Kitabı oxu: «Компонентный состав эфирных масел дикорастущих лекарственных растений флоры Сибири»
Введение
В настоящее время наблюдается устойчивая тенденция возрастания интереса к дикорастущим лекарственным растениям и их действующим веществам. И это неудивительно. Ведь человек – неотъемлемая часть природы, и жизнь его неразрывно связана с растительным миром, в результате чего природные соединения стали для человеческого организма жизненно необходимыми факторами всех метаболических процессов.
Растительный мир – неисчерпаемая кладовая природного лекарственного сырья. На протяжении тысячелетий, с глубокой древности, растения были единственными лечебными средствами. И сегодня лекарственные растения и препараты из них служат незаменимым сырьем для получения целого ряда лекарственных средств. Каждый третий лечебный препарат готовится из лекарственного растительного сырья. К тому же большое внимание уделяется местным растительным ресурсам. Это делает лекарственные средства значительно дешевле и расширяет ассортимент лекарств отечественного производства. Важную роль в этом плане играют эфиромасличные растения, многие из которых имеют обширный ареал и формируют значительную фито-массу, что определяет перспективы их практического использования.
В Сибири насчитывается почти 3000 видов растений, из них более 500 видов – лекарственные. В Красноярском крае известны как лекарственные около 300 видов, из них более 100 используются в современной фармакологии, 30 занесены в Красную книгу России, а остальные применяются при традиционном лечении и изучаются в качестве перспективных лекарственных средств. В промышленном масштабе на территории края возможна заготовка около 70-80 видов растений, среди которых необходимо отметить тысячелистник обыкновенный, душицу обыкновенную, багульник болотный, различные виды полыни, зверобой продырявленный, лабазник вязолистный, володушку золотистую и др.
Учитывая тот факт, что синтез и накопление отдельных классов биологически активных веществ в дикорастущих растениях в существенной мере определяется природно-климатическими условиями их произрастания, необходимо исследовать компонентный состав эфирного масла дикорастущих лекарственных растений, произрастающих в резко континентальном климате Красноярского края, территория которого протянулась с севера на юг почти на 2990 км, и определить основные области их применения в качестве лечебно-профилактических средств. Здесь же может быть и целый ряд научных задач, суть которых заключается в исследовании механизма синтеза отдельных классов соединений в самом сырье по мере его роста и развития, метаболизма отдельных соединений, в разработке методов идентификации и выделения отдельных соединений.
По-прежнему актуальна проблема диагностики и стандартизации лекарственного сырья, связанная с его неоднородностью по химическому составу, а значит, и фармакологическому действию. Для решения этой проблемы необходимо знание природы биологически активных веществ в исследуемом растении. Возможно, изучение компонентного состава эфирных масел лекарственных растений позволит установить компоненты-маркеры, специфические для того или иного растения, произрастающего в климатических условиях Сибирского региона, что в свою очередь позволит решить вопросы стандартизации фитопрепаратов на их основе.
Глава 1
Эфиромасличные растения: современное состояние исследований состава их эфирных масел
1.1. Степень изученности и перспективность исследований эфирных масел дикорастущих растений
Общее число эфиромасличных растений мировой флоры оценивается в 2500-3000 видов. Важнейшие среди них виды следующих родов: Citrus, Eucalyptus, Abies, Anethum,Lavanda, Mentha, Thymus, Carum, Coriandrum, Foeniculum, Salvia, Juniperus, Rosa, Rosmarinus, Pinus,Ocimum, Artemisia, Geranium, Acorus, Pimpinella, Nepeta, Monarda, Laurus, Lophanthus, Iris и др. За период существования СССР во флоре страны было определено 1100–1300 видов эфиромасличных растений, которые представляют 77 семейств. Главные семейства, включающие большее число эфиромасличных растений, – это Lamiaceae, Apiaceae, Asteraceae.
В обзоре К. Г. Ткаченко [1] показано, как изменялся уровень изучения эфиромасличных растений и эфирных масел от органолептического к приборному, от получения первичных физико-химических констант к препаративному выделению компонентов, в последние годы и к микроанализу, позволяющему устанавливать до 95 % компонентов состава эфирных масел в малых пробах.
Первые сводки о душистых растениях, имеющих хозяйственное использование, были основаны на органолептических данных, так как аналитические методы выделения эфирных масел еще не были развиты. Во многом прорыв в изучении флоры России и СССР на выявление эфирномасличных растений стал возможен после изобретения удобного лабораторного прибора для выделения и количественного определения искомого продукта в эфиромасличных растениях – аппарата А. С. Гинзберга [1].
В течение ХХ в. не только проводился скрининг эфиромасличных растений, но разрабатывались разные методы извлечения и анализа эфирных масел. Многократно претерпевали изменения способы лабораторного и промышленного получения масел. Стремительное развитие приборной и аналитической базы и органических соединений, примерно каждые 20-30 лет, способствовало более детальному и тонкому анализу эфирных масел. Если до 1950-х гг. большим достижением считалось приведение физико-химических констант (эфирного и кислотного числа, рН, угла поляризации, удельного веса) и основных классов компонентов (кислоты, спирты, сложные эфиры, терпены) эфирного масла, то уже с открытием газовой хроматографии (после 1950-х гг.) и тем более с появлением хромато-массспектрометрического анализа (с середины 1970-х гг.) исследования в области эфиромасличных растений и идентификации компонентов стали невероятно стремительно двигаться [1].
На протяжении последних лет проводятся ежегодные европейские конференции, посвященные всестороннему изучению эфиромасличных растений и их масел. Раз в пять лет проходят специализированные конгрессы по эфирным маслам и эфиромасличным растениям. Число научных журналов, публикующих работы о компонентном составе эфирных масел, уже достигает нескольких десятков. На текущий момент центрами изучения эфирных масел стали Индия, Турция, Соединенные Штаты Америки, Китай, Бразилия и Египет, печатающие подавляющее число работ в этой области [1].
В Сибири первые промышленные заготовки эфирных масел были проведены в 1929 г. Они показали, что для широкомасштабного развития эфиромасличной промышленности недостаточно сырья, заготавливаемого из дикорастущей флоры, а поэтому необходимо развивать интродукцию этих растений. В этой связи на Алтае и в Хакасии было начато выращивание и переработка мяты перечной, иссопа, мелиссы и других душистых растений. Однако нерентабельность кустарного производства переработки эфиромасличного сырья приводила к постепенному отмиранию производства. В результате в Сибири так и не были созданы промышленные плантации и мощности по переработке сырья душистых растений. Как отрасль эфиромасличная промышленность развивалась, главным образом, в европейской части и на юге СССР [2].
Работы по изучению эфиромасличных культур возобновились в Сибири только в период Великой Отечественной войны, когда основные районы заготовок промышленных эфироносов были блокированы. В 50-е гг. в Центральном Сибирском ботаническом саду (ЦСБС, Новосибирск) под руководством К. А. Соболевской было проведено испытание 33 новых для Сибири эфиромасличных культур и свыше 240 сортообразцов из различных районов СССР. В результате этих исследований авторы сделали вывод, что климатические условия Западной Сибири вполне благоприятны для культивирования растений, содержащих эфирные масла. Ресурсные исследования, проведенные в районах Алтая и Хакасии, позволили предложить для дальнейшего исследования более 50 видов эфиромасличных растений из семейств Ericaceae, Lamiaceae и Asteraceae [3, 4].
Два последних десятилетия отличаются качественно новым уровнем в изучении эфиромасличных растений флоры Сибири. Был выявлен ряд перспективных проазуленсодержащих видов: Artemisia sieversiana, A. macrocephala, A. pontica, A.samoiedorum, A.jacutica и Achillea asiatica [4-9]. Как показали фармакологические исследования, эфирные масла перечисленных растений обладают выраженным ранозаживляющим и противовоспалительным действием.
Богатая сырьевая база и высокое содержание эфирного масла (1,5-6 %) позволяют выдвинуть в число перспективных растения семейства Ericaceae: Ledum macrophyllum как дополнительный источник ледола; Ledum hypoleucum – в качестве источника антифугальных средств; Rododendron dauricum – как источник антифугальных и диуретических средств. Эфирные масла и экстракты всех перечисленных видов обладают также противовоспалительным и антибактериальным действием [10-13].
Теоретическому и экспериментальному обоснованию возможности расширения сырьевой базы лекарственных эфиромасличных растений за счет видов рода Artemisia L., произрастающих в Сибири, а также за счет культивирования наиболее ценных видов (A. jacutica) посвящены исследования М. А. Ханиной с соавторами [9, 14-17]. Ими проведено изучение химического состава и анатомической структуры более 100 видов полыни, выявлен ряд очень важных закономерностей в накоплении эфирного масла и кумаринов в зависимости от систематического положения и эколого-географической приуроченности видов.
Активно ведутся работы по изучению компонентных составов эфирных масел растений Алтайского края [18-21].
Исследованию биологически активных веществ дикорастущего эфиромасличного сырья, произрастающего на территории Красноярского края, посвящено ряд работ А. А. Ефремова с соавторами, выполненных на кафедре химии Сибирского федерального университета. Основная часть публикаций посвящена изучению компонентного состава эфирных масел исследуемых растений с использованием современного хромато-масс-спектрометрического метода. Большое внимание уделено в работах исследованию зависимости состава масла, полученного методом исчерпывающей гидропародистилляции, от вида сырья, продолжительности отгонки, места произрастания, а также изучению бактерицидных и антиоксидантных свойств эфирных масел [22-47].
Таким образом, на основании проведенного анализа литературы видно, что выявление и комплексное изучение эфиромасличных растений, эфирных масел и поиск путей нового применения в разных отраслях народного хозяйства не только актуально в текущем столетии, но и приобретает особую важность, научное и практическое значение.
1.2. Эфирное масло: области локализации, способы извлечения и исследование компонентного состава
1.2.1. Местонахождение эфирных масел в растениях
Эфирные масла – сложные смеси органических веществ, главным образом терпеновой природы, получаемые из растений и обуславливающие их приятный запах. Наиболее часто они выделяются из растений, принадлежащих ботаническим семействам Сосновых (Pinaceae), Кипарисовых (Cupressceae), Зонтичных (Umbelliferae), Миртовых (Myrtaceae), Лавровых (Lauraceae), Рутовых (Rutaceae), Губоцветных (Labiatae), Сложноцветных (Compositae), Имбирных (Zingiberaceae), Гераниевых (Geraniaceae), Розоцветных (Rosaceae), Мускатниковых (Myristicaceae), Санталовых (Santalaceae), Перцевых (Piperaceae), Маслиновых (Oleaceae), Аноновых (Annonacaea), а также некоторых представителей семейства Злаков (Gramineae).
Эфирные масла в растениях могут находиться в протоплазме или клеточном соке диффузно в растворенном или эмульгированном состоянии, могут накапливаться в отдельных клетках – идиобластах (как аира, лавра, камфорного дерева) – или же концентрироваться в определенных вместилищах. Вместилища подразделяются на внешние (экзогенные), расположенные в наружных тканях, пространственно связанных с эпидермисом, и внутренние (эндогенные) [48, 49].
К экзогенным вместилищам относятся:
Железистые пятна – наиболее простые внешние железы, возникающие в результате отслаивания кутикулы от клеточной стенки. Это пространство служит местом скопления эфирного масла. Железистые пятна часто встречаются в зубчиках листьев и в кожице лепестков цветков, обладающих запахом.
Железистые волоски – специализированные органы, состоящие из железистой головки (выделительного органа), и ножки, по большей части одноклеточной.
Железистые чешуйки – внешне напоминают булавочные головки и отличаются очень короткими ножками. Строение этих чешуек – отличительный систематический признак.
Эндогенные вместилища развиваются во внутренних тканях растения и подразделяются на железистые клетки и вместилища железистых выделений:
железистые клетки располагаются в тканях одиночно или образуют слои. Железистая клетка выделяет свой секрет (эфирное масло) в межклеточное пространство, которое становится вместилищем;
вместилище может быть схизогенным, образующимся в результате разъединения клеток (например, у зверобоя и у зонтичных), или лизигенным, возникающим путем растворения части клеток (например, у цитрусовых); может развиваться в каналы, которые характерны для определенных видов и частей растений (каналы в коре корней, а также в коре и сердцевине стеблей, в плодах растений семейства зонтичных).
Содержимое вместилищ включает в себя не только эфирные масла (это лишь часть вторичных метаболитов), но и нелетучие вещества (ди-, три- и тетратерпеноиды, полипренолы, алкалоиды, гликозиды, полифенолы, кумарины, флавоноиды, лигнаны, жирные кислоты и их эфиры, жирные спирты и их эфиры).
Осуществление железистым аппаратом органа своей функциональной роли взаимосвязано с физиологическими процессами, протекающими в этом органе, и жизнедеятельностью целого растения. Биосинтез эфирных масел требует непрерывного обеспечения «строительным материалом», т.е. предшественниками и энергией. Так, в работе Н. Ю. Лысяковой выявлена взаимосвязь между уровнем накопления эфирного масла в растении и активностью фотосинтеза [50].
Природу и функции секреторных желез в настоящее время изучают с применением новейшего инструментария и методов анализа [51]. Уже разработаны методы изолирования и создания «чистых» препаратов желез в значительных количествах [52]. Принципиально новые знания о выделительных железах будут получены в результате комплексного применения методов прижизненного экофизиологического, молекулярного и клеточного анализов.
Характер распределения эфирных масел в растении является основой для выбора оптимального способа извлечения эфирного масла. Экзогенные вместилища располагаются на самой поверхности покровов растения, оказываются наиболее доступными в плане экстракции, а потому извлечение из них происходит весьма быстро и эффективно, поскольку тонкие стенки, окружающие экзогенные вместилища, легко разрушаются горячим паром. Как правило, при обработке растений, содержащих эфирное масло главным образом в экзогенных вместилищах, кратковременная обработка паром дает практически полное извлечение эфирного масла.
Напротив, при локализации эфирного масла в эндогенных вместилищах требуется значительно бóльшее время для полного извлечения веществ водяным паром. Особенно это относится к случаям, когда вместилищами служат каналы, «запрятанные» глубоко в тканях растения – древесине или даже сердцевине стеблей и корней.
Подавляющая часть компонентов эфирных масел представлена липофильными соединениями, поэтому они не могут присутствовать в водных растворах в заметном количестве и по мере их образования должны транспортироваться к месту хранения (накопления). Таким образом, следует полагать, что большая часть эфирного масла сосредоточена в специализированных хранилищах, а доля масла в местах, в которых происходит биосинтез и по которым осуществляется транспорт, незначительна [53, 54].
К настоящему времени накоплен обширный материал по характеру и структуре клеток и клеточных комплексов, продуцирующих и накапливающих эфирное масло в растениях. Так, представителям семейств Зонтичных и Губоцветных (Apiaceae и Lamiaceae) присуще крайнее однообразие в строении секреторных систем, в то время как у растений семейства Asteraceae характер и строение секреторных структур значительно варьируют. Накопление эфирного масла для большинства растений семейства Зонтичных, в том числе и для рода Seseli, происходит в схизогенных вместилищах и схизогенных каналах, которые являются секреторными образованиями эндогенной природы. Так, семена борщевиков имеют эфиромасличные каналы: как правило, два на вентральной (внутренней) и четыре на дорзальной (наружной) стороне плодика [55].
У 46 родов семейства Губоцветных эфирные масла накапливаются только в железистых трихомах. Железистые трихомы – эпидермальные секреторные образования, состоящие из одной или нескольких клеток, продуцирующие и одновременно накапливающие секрет [56, 57].
Для представителей рода Artemisia характерны три типа железистых структур: схизогенные вместилища, железистые трихомы, а также неспециализированные паренхимные клетки. Известно, что в разных структурах могут накапливаться смеси терпеноидов разного состава. Например, в листьях Artemisia dracunculus эфирное масло схизогенных каналов и железистых волосков имеет разный компонентный состав [58].
Секреторные структуры родов Origanum и Schizonepeta меньше всего подвержены нарушениям целостности, и, следовательно, эфирное масло лучше сохраняется, а его компоненты более устойчивы к окислительному воздействию воздуха. Все остальные виды имеют секреторные каналы, которые при разрыве растений на части (или измельчении) нарушаются, что приводит (1) к ускорению улетучивания легкокипящих компонентов из-за повреждения защитных оболочек вместилищ масла и (2) к более заметному изменению компонентного состава за счет проникновения кислорода воздуха в секреторные каналы. Разрыв растений на части (при измельчении) приводит к сильным изменениям только той части эфирного масла, которая находится в секреторных каналах, поскольку при любой ломке растения в первую очередь будет нарушаться целостность именно схизогенных каналов.
Компоненты эфирных масел в растениях находятся в свободном и связанном состояниях. Под связанным состоянием понимают биогенетически соответствующие тем или иным веществам гликозиды, лактоструктуры и пирофосфатные интермедиаты вторичного метаболизма. Такие формы содержания позволяют растениям сохранять значительное количество летучих веществ на протяжении всего цикла их развития. При этом связанные компоненты не имеют строго ограниченной локализации и обычно равномерно распределяются по тканям промышленной части растений. Теоретически это можно представить как своеобразный запас таких веществ для стабильного протекания биологических процессов в растении. Свободные компоненты – это вещества, содержащиеся в растениях в том виде, в которых они присутствуют в эфирном масле после его извлечения из сырья [59]. Свободные компоненты легко улетучиваются и обеспечивают душистые характеристики эфироносов. Однако некоторая часть свободных веществ всё же удерживается растениями на секреторном уровне [60].
Важно понимать, что не все перечисленные типы локализации летучих веществ характерны для тех или иных видов эфиромасличного сырья. Так, например, зерновому и корневому эфиромасличному сырью свойственны внутренние эфиромасличные хранилища в форме каналов, при этом зерновое сырье обладает низкой влажностью, что препятствует внутреннему гидролизу и, как следствие, освобождению некоторого числа летучих веществ из связанных форм. Эти отличительные особенности позволяют хранить зерновое сырье длительный срок без заметных потерь эфирного масла [59].
Цветочное сырье, напротив, очень быстро теряет масло и поэтому перерабатывается в свежесобранном состоянии. Это также обусловлено структурной особенностью эфиромасличных хранилищ. В сырье этого типа преобладают экзогенные волоски и железы, которые в первую очередь подвержены деструкции [60].
Травянистое эфиромасличное сырьё в своей структуре заключает как экзогенные, так и эндогенные образования, поскольку по своей сути травянистое сырье представляет собой существенную часть надземных органов растения [61].
1.2.2. Способы выделения эфирных масел
Существует несколько способов извлечения ароматических веществ из растений.
Перегонка с водяным паром . Старинный и до сих пор наиболее распространенный способ получения эфирных масел. Его используют во всех случаях, когда сырье содержит сравнительно много эфирного масла и температура перегонки (около 100 °С) не отражается на его качестве.
Температура кипения отдельных компонентов эфирных масел колеблется от 150 до 350 °С. Так, например, пинен кипит при 160 °С, лимонен – при 177 °С, гераниол – при 229 °С, тимол при 233 °С и т. д. Однако все эти вещества в присутствии водяного пара перегоняются при температуре ниже 100 °С. Теоретические основания процесса перегонки с водяным паром вытекают из закона Дальтона о парциальных давлениях, согласно которому смесь жидкостей (взаимно нерастворимых и химически друг на друга не действующих) закипает тогда, когда сумма их парциальных давлений достигнет атмосферного давления.
Перегонку с водяным паром осуществляют в перегонных кубах или, для переработки больших количеств сырья, в непрерывно действующих перегонных аппаратах. Перегонка с водяным паром может проводиться не только при атмосферном давлении, но и под давлением перегретым паром. В этом случае соотношение воды и эфирного масла выгодно меняется в пользу увеличения перегоняемого масла. Это объясняется тем, что уменьшение упругости паров воды идет сильнее, не пропорционально изменению упругости паров эфирного масла [62].
Экстракция. Эфирные масла растворяются во многих легколетучих органических растворителях. Это свойство используется в тех случаях, когда компоненты эфирных масел термолабильны и подвергаются деструкции при перегонке с водяным паром. При экстракции сырье, помещенное в специальные экстракторы, подвергают извлечению петролейным эфиром, этиловым эфиром, ацетоном или иным экстрагентом. Далее экстрагент отгоняют, конденсируют и вновь направляют в процесс. Экстракторы работают по принципу аппарата Сокслета (если повторный нагрев экстракта в приемнике не отражается на качестве масла).
После отгонки растворителя остаток представляет собой чистое эфирное масло или смесь эфирного масла с другими извлеченными веществами – смолами, восками и т. п. Такие экстракты, называемые «пахучими восками», используются в натуральном виде или перерабатываются с целью выделения из них эфирного масла (экстракция спиртом и отгонка последнего под вакуумом).
В последнее время экстракцию эфирных масел стали проводить сжиженными газами (углекислый газ, бутан и др.).
К экстракционным способам получения эфирных масел должна быть отнесена и мацерация цветочного сырья жирами. Для этого сырье в тканевых мешочках погружают в емкость с жировым корпусом на 24-48 ч. Далее эфирное масло извлекают спиртом [63].
Анфлераж. В анфлераже выделяющееся из сырья (преимущественно из цветков) эфирное масло поглощается сорбентами (твердые жиры, активированный уголь и др.). Этот процесс проводится в специальных рамах, герметично собираемых по 30-40 шт. (одна на другую) в батарею.
При работе с твердыми жирами на обе стороны стекла (рамы) наносят жировой сорбент (смесь свиного и говяжьего жира и др.) слоем 3-5 мм. Цветки раскладывают поверх сорбента толщиной до 3 см и оставляют на 48-72 ч, после чего удаляют, а на рамы помещают свежее сырье. Такую операцию проводят многократно (до 30 раз), пока сорбент не будет насыщен эфирным маслом. Отработанное сырье содержит еще некоторое количество эфирного масла (преимущественно тяжелые фракции), поэтому дополнительно перерабатывается экстракцией. Жир, насыщенный эфирным маслом, снимают со стекла. Из полученной таким образом помады эфирное масло извлекают спиртом с последующим вымораживанием и фильтрацией. Далее после отгонки в вакууме получают чистое эфирное масло.
При использовании в качестве сорбента активированного угля сырье (цветки) помещают в камеру на сетки, после чего камеру герметично закрывают и через нее продувают сильный ток влажного воздуха, уносящий с собой пары эфирного масла, выделяемого цветками. Масло из воздуха поглощается активированным углем, расположенным над камерой. Через сутки цветки из камеры выгружают и экстрагируют петролейным эфиром для извлечения оставшихся в них тяжелых фракций эфирного масла. Активированный уголь, после его насыщения эфирным маслом, элюируют этиловым эфиром. После отгонки элюата получают эфирное масло [63].
Мацерация. Экстракция теплым маслом: цветки помещают в нагретый до 80o С жир и выдерживают определенное время, после этого цветы отжимают, а в полученное душистое масло помещают новую порцию цветков. Всю процедуру повторяют до тех пор, пока масло не окажется достаточно насыщенным ароматами цветов.
Механические способы . Механические способы применяют при производстве эфирных масел из плодов цитрусовых, поскольку в них эфирные масла локализуются в крупных вместилищах кожуры плодов. Их получают путем прессования или соскребывания. Прессование проводят на гидравлических прессах из кожуры, оставшейся после отжатия из плодов сока. Для этого кожуру предварительно пропускают через зубчатые вальцы. Оставшееся (до 30 %) в кожуре эфирное масло извлекают далее перегонкой с водяным паром. Соскребывание (натирание) проводят с кожуры целых плодов вручную с помощью специальных ложек с зазубренными краями или металлических дисков с большим количеством тупых игл.
Выделение эфирных масел производят как из свежего, так и из высушенного материала. Сушка как один из видов консервирования позволяет осуществлять перегонку в течение всего года и таким образом полнее использовать технологическую аппаратуру. Однако не все эфиромасличные растения можно высушивать. Некоторые виды сырья (лаванда, роза и др.) требуют перегонки в свежем виде, так как самые непродолжительные сроки хранения (2-3 часа) значительно снижают выход масла. Для других видов сырья правильно проведенная сушка даже полезна, так как ведет к увеличению выхода эфирного масла.
Увеличение выхода эфирного масла в сырье, прошедшем правильную сушку при оптимальной температуре (25-30 °С), объясняют благоприятными условиями для деятельности ферментов. Следует помнить, что после сбора сырья (листьев, цветков и т. п.) в живой ткани в течение некоторого времени протекают процессы обмена веществ. В результате качественный состав (чаще соотношение отдельных компонентов) эфирного масла из подвяленных частей растения может быть несколько иной, чем масла, сразу выделенного из свежего растения.
Авторами данной работы выделение эфирного масла из исследуемых растений осуществлялось методом исчерпывающей гидропародистилляции при атмосферном давлении в аппарате из нержавеющей стали (рис. 1) согласно [38]. По терминологии, сформировавшейся в промышленности эфирных масел, гидропародистилляция (англ. water and steam distillation) заключается в следующем: сырье располагается на сетке над поверхностью кипящей воды; сырье контактирует только с горячим паром, но не контактирует с водой.
Рис. 1. Цельнометаллическая установка для получения эфирного масла: 1 – обратный холодильник, 2 – насадка Клевенджера, 3 – перегонный куб, 4 – электроплитка
Средняя проба воздушно-сухого сырья, взятого в эксперимент, составляла 800-1200 г в зависимости от вида сырья. Продолжительность процесса гидропародистилляции устанавливали экспериментально на основании изучения динамики изменения выхода эфирного масла во времени. В случае выделения эфирного масла из корней и корневищ продолжительность гидропародистилляции составляла не менее 20 ч до прекращения выделения эфирного масла. Полноту выделения масла контролировали экспериментально.
Количественно собранное в насадке Клевенджера эфирное масло отстаивали, а затем высушивали над Na2SO4. Если масла отгонялось незначительное количество, то его экстрагировали гексаном.
Как известно, эфирные масла представляют собой многокомпонентные смеси соединений, относящихся к разным классам и группам и отличающихся по степени летучести. В этой связи, очевидно, компонентный состав масла и его физико-химические показатели будут различаться в зависимости от времени перегонки. Поэтому трудно иногда сравнивать литературные данные по составу и физико-химическим характеристикам эфирных масел исследуемых растений с собственными результатами, так как разные исследователи либо не приводят в своих работах время отгонки, либо время отгонки эфирного масла из одного и того же растения в разных работах различное.
При получении эфирного масла из растительного сырья вопрос продолжительности процесса актуален. Ведь процесс гидропародистилляции может продолжаться час, два, три, десять и более. Все определяется тем, какие цели ставит перед собой исследователь. Если он изучает лишь первичные метаболиты эфирного масла, тогда процесс должен осуществляться в течение малого промежутка времени. А если надо определить содержание эфирного масла в сырье, то этот процесс должен осуществляться в течение времени, достаточного для выделения всех компонентов эфирного масла. Это положение считается важным и потому, что в таком случае полученное эфирное масло будет иметь физико-химические характеристики именно самого масла, а не каких-то отдельных фракций. Процесс будет исчерпывающим. Метод исчерпывающей гидропародистилляции, применяемый авторами данной работы для извлечения эфирного масла, и заключается в том, что вначале исследователь экспериментально определяет время, в течение которого происходит выделение всех компонентов эфирного масла из данного растительного сырья, определяя при этом и содержание масла в сырье, и его физико-химические характеристики (плотность и показатель преломления).
Если выход эфирного масла составляет 0,5-3,0 %, то имеет смысл изучение динамики его отгонки. Нами была исследована динамика отгонки эфирного масла корневищ аира болотного, надземной части душицы обыкновенной и тысячелистника обыкновенного, борщевика рассеченного, полыни Сиверса и полыни холодной, семян пастернака дикого. В процессе отгонки масло фракционировали в зависимости от продолжительности его выделения. Каждую фракцию масла отбирали через определенные промежутки времени. Измерение показателя преломления отдельных фракций масла продемонстрировало, что эта величина изменяется со временем и, как правило, увеличивается, что свидетельствует об увеличении доли компонентов масла, имеющих более высокое значение показателя преломления.
Хромато-масс-спектрометрический анализ полученных фракций эфирного масла подтверждает изменение состава масла в процессе его выделения. Общая тенденция такова, что с увеличением времени перегонки содержание легколетучих компонентов уменьшается, а труднолетучих – увеличивается. Кроме того, отмечено, что отдельные фракции масла содержат максимальное количество того или иного компонента, ответственного за фармакологическое действие полученного эфирного масла. Поэтому разные фракции масла, имея разный компонентный состав, будут, очевидно, проявлять отличные друг от друга бактерицидные, антиоксидантные и прочие свойства.
1.2.3. Хромато-масс-спектрометрическое исследование компонентного состава эфирных масел
Хромато-масс-спектрометрическое исследование эфирного масла состоит из двух этапов: (1) регистрации хромато-масс-спектрограммы приготовленного образца и (2) расшифровки полученной хромато-масс-спектрограммы. Все преимущества и тонкости данного метода подробно описаны в монографии А. В. Ткачева [64].
Авторы данной работы хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на хроматографе Agilent Technologies 7890 А с квадрупольным масс-спектрометром MSD 5975 С в качестве детектора. Использовали кварцевую колонку HP-5 (сополимер 5 %-дифенил – 95 %-диметилсилоксан) с внутренним диаметром 0,25 мм. Температура испарителя составляла 280 °С, температура источника ионов 173 °С, газ-носитель – гелий, 1 мл/мин. Температура колонки: 50 °С (2 минуты), программируемый нагрев 50-270 °С со скоростью 4 °С в минуту, изотермический режим при 270 °С в течение 10 мин.
Содержание компонентов исследуемых эфирных масел оценивали по площадям пиков на хроматограмме без учета поправочных коэффициентов:
где ci – содержание в смеси компонента (в %), Si – площадь пика i-го компонента.
Так как поправочные коэффициенты (коэффициенты чувствительности) масс-спектрометрического детектора для различных соединений различны [64], то содержание компонентов, определенное этим методом, является оценочным. Для точного определения содержания компонентов в эфирных маслах необходимо использовать пламенно-ионизационный детектор, чувствительность которого к различным углеводородам с содержанием более 8 атомов углерода практически одинаковая [65].
Что касается компонентного состава эфирных масел дикорастущих растений, то следует указать на возможность некоторой неоднозначности в идентификации индивидуальных компонентов в ранее проведенных работах. Идентификация компонентов, основанная на времени удерживания, всегда включала элемент неоднозначности ввиду того, что некоторые компоненты имели одно и то же время удерживания, или, иначе говоря, практически не разделялись на набивных колонках. С появлением капиллярных колонок данная проблема практически была решена, так как на капиллярных колонках эффективность разделения была достаточной даже для разделения оптических изомеров. Однако время удерживания не является абсолютным хроматографическим репером, так как оно заметно изменяется по мере «старения» или приработки колонок как набивных, так и капиллярных. Более того, очень часто компоненты сложных смесей, относящиеся к различным классам органических соединений, могли иметь и имели одинаковое время удерживания, что затрудняло однозначную идентификацию этих компонентов.
С появлением хромато-масс-спектрометрии задача идентификации органических компонентов упростилась, так как масс-спектры различных компонентов заметно различаются. К сожалению, это не всегда справедливо, особенно для сложных органических компонентов, различающихся положением двойной связи или положением определенных заместителей. Продемонстрируем это на ряде практических примеров. Так на рис. 2-4 приведены экспериментальные масс-спектры, полученные нами в ряде работ. Очевидно, что данные масс-спектры очень похожи друг на друга, так как характеризуют изомерные соединения. Обращение к банку данных Willey или NIST08 выдает равновероятное их отнесение ко всем трем изомерам: трициклену, α-пинену, β-пинену, что не совсем правомочно. В таком случае масс-спектрометрической информации (масс-спектрометрических точек идентификации) оказывается недостаточно, и наряду с этим для однозначной идентификации необходимо привлекать хроматографические точки идентификации, в качестве которых приняты так называемые линейные индексы удерживания (RI) [64, 66, 67].
Линейные индексы удерживания, определяемые на капиллярных колонках длиной 30 м и более, могут однозначно указывать на отнесение определяемых веществ к тем или иным соединениям. Для определения линейных индексов удерживания разделяемых компонентов эфирного масла необходимо прописать смесь предельных неразветвленных углеводородов С6 – С25 в режиме линейного программирования температуры со скоростью 2-6 град / в мин. и в этих же условиях прописать хроматограмму разделения компонентов исследуемого эфирного масла.
Рис 2. Масс-спектр трициклена: RT = 6,0; RI = 924; RIlib=921
Рис 3. Масс-спектр α-пинена: RT = 6,4; RI = 935; RIlib=932.
Рис. 4. Масс-спектр β-пинена: RT = 7,7; RI = 978; RIlib=975
Программа AMDIS, имеющаяся в компьютере, сама рассчитывает линейные индексы удерживания, которые являются абсолютными реперами для идентификации индивидуальных компонентов [64, 67]:
где Jn = 100n – индекс удерживания н-алкана, содержащего в молекуле n атомов углерода; tRx – время удерживания исследуемого вещества; tRn – время удерживания н-алкана, выходящего до исследуемого вещества; tR(n+k) – время удерживания н-алкана, выходящего за исследуемым веществом.
Совпадение хроматографической точки идентификации предполагает, что индекс удерживания пика идентифицируемого компонента попадает в диапазон ± 3 е. и. по отношению к индексу удерживания имеющемуся в литературе аналогу. В вышеприведенном случае для трициклена, α-пинена и β-пинена определенные линейные индексы удерживания равны 924, 935 и 978 соответственно и не отличаются от библиотечных индексов более чем на 3 единицы.
Ранее в [38] мы также указывали на неоднозначность в идентификации изомеров кадинена только лишь по масс-спектрам, которые практически не различаются (различия состоят не массах осколков, а в относительных интенсивностях отдельных осколков), однако их линейные индексы удерживания различаются заметно, что упрощает идентификацию этих соединений. Для γ-кадинена, δ-кадинена и α-кадинена линейные индексы удерживания составляют 1517, 1527 и 1541 соответственно.
Таблица 1
Допустимые интервалы изменения интенсивности пиков в зависимости от их относительной интенсивности
Отметим, что при анализе масс-спектров идентифицируемых компонентов необходимо тщательно сравнивать весь диапазон масс образующихся осколков, так как масс-спектрометрические точки идентификации предполагают не только совпадение масс осколков, но и их интенсивностей. Так в [68] указывается, что допустимые интервалы изменения интенсивностей осколков в масс-спектрах должны укладываться в указанные в табл. 1 величины.
Также необходимо отметить, что только при полном совпадении линейных индексов удерживания и полных масс-спектров определяемых компонентов можно считать идентификацию однозначной и достоверной.
Глава 2
Характеристика исследуемого растительного сырья, произрастающего в Сибири
2.1. Лабазник вязолистный – Filipendula ulmaria (L.) Maxim
Род Лабазник относится к одному из крупных семейств цветковых растений – Розоцветные (Rosaceae), насчитывающий 15 видов, среди которых лабазник вязолистный (Filipendula ulmaria (L.) Maxim) (рис. 5), лабазник дланевидный (Filipendula palmata (Pall.) Maxim), лабазник камчатский (Filipendula camtschatica), лабазник красный (F. rubra (Hill) Rob), лабазник обыкновенный, или шестилепестной, (F. hexapetala) и др. [69].
Ботаническое описание и биологические особенности
Лабазники довольно разнообразны по своему размеру, форме листьев и окраске цветков. Но все они обладают очень характерной формой соцветия – это густая многоцветковая метелка с укороченной центральной осью и длинными нижними ветвями. У лабазников перисторассеченные листья, то есть листья, у которых пластинка глубоко, до самой центральной жилки, рассечена на более мелкие доли и напоминает сложный перистый лист. При этом у большинства видов конечная долька листа более крупная, глубоко пальчато надрезана на несколько, от трех до одиннадцати, заостренных и пильчатых по краю лопастей и напоминает по форме кленовый лист. Боковые «перышки» более мелкие, в числе от одной до десяти пар, а у некоторых видов и вовсе не развиты.
Большинство лабазников достаточно крупные травянистые многолетники. В течение вегетационного сезона они регулярно проходят различные стадии развития надземных побегов. Весной они развивают крупные листовые розетки, из центра которых в начале лета начинает подниматься цветоносный побег, достигающий у ряда видов 2-2,5 м высоты. Период отрастания у лабазника вязолистного в природе приходится на конец третьей декады марта. Молодые побеги развиваются с середины июня – начала июля. Одновременно происходит формирование новых отрезков корневища и рост молодых корней, отходящих от него [69-72].
Рис. 5. Лабазник вязолистный
В динамике роста растений прослеживается четкая тенденция: в период от всходов до начала образования стебля растения растут медленно, а затем начинают расти интенсивней, а после массового цветения их рост замедляется, а затем совсем прекращается. В течение вегетационного периода в очень сухую жаркую погода прохождение всех фаз наступает раньше. В период исследований лабазник вязолистный в естественных условиях Красноярского края проходил все фазы вегетации.
Ареал. Лабазники распространены по всей умеренной зоне северного полушария. В дикой природе они растут в Европе, Сибири, на Дальнем Востоке, в Гималаях и в Северной Америке [69, 73]. На территории Красноярского края известно около 200 местонахождений лабазника во всех районах лесной и степной зон [74].
Применение в медицине. Лабазник вязолистный имеет чрезвычайно широкий спектр применения в медицине. Это обусловлено его составом, в который входит витамин C, дубильные вещества, фенольные соединения, а также салициловая кислота и ее производные (салициловый альдегид, метилсалицилат и т.п.) [75, 76]. Корневища растения содержат помимо этого фенолгликозиды (монотропитин и спиреин), флавоноиды и халконы. Стебли и листья имеют в составе кате-хины, фенолкарбоновые кислоты (эллаговую и кофейную), эфирные масла и высшие жирные кислоты (линолевую, стеариновую и др.). Благодаря такому богатому составу лабазник может использоваться в качестве тонизирующего, общеукрепляющего, успокоительного, бактерицидного, диуретического, вяжущего, кровоостанавливающего, ранозаживляющего и противогельминтного средства. Он также обладает желчегонным свойством и усиливает способность печени бороться с токсическими поражениями организма.
Препараты лабазника помимо вышеперечисленного помогают при головных болях, ревматических поражениях суставов, сахарном диабете и также могут применяться как противовирусное средство.
Антиканцерогенные и противодиабетические свойства цветков Filipendula ulmaria (L.) Maxim изучены в работе [77]. Показано, что препараты из цветков лабазника вязолистного могут эффективно тормозить развитие злокачественных опухолей различных локализаций и различного гистогенеза, а также препятствовать прогрессированию предраковых изменений. Флавоноиды, а также фенольные гликозиды и полифенольные соединения, входящие в состав цветков лабазника, обладают антиоксидантной активностью, тогда как широко известно, что предотвращение свободнорадикального повреждения клеток тормозит развитие опухолей.
Салицилаты, входящие в состав цветков лабазника, способны тормозить биосинтез лейкотриенов, простагландинов и других эйкозаноидов – продуктов метаболизма арахидоновой кислоты [78].
Цветки лабазника вязолистного широко используются в народной медицине в качестве противовоспалительного, противоязвенного, ранозаживляющего, антимикробного и седативного средства, для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, почек и мочевыводящих путей, верхних дыхательных путей, ревматизма, эпилепсии и других нервных болезней [74, 79].
Фармакологические исследования показали, что экстракты и фракции растения обладают выраженной ноотропной активностью. А фито-химические исследования указывают на высокое содержание фенольных соединений в надземной части растения, антиоксидантное, антигипоксическое и гемореологическое действие которых широко известно [80].
2.2. Володушка золотистая – Bupleurum aureum Fisch
Ботаническое описание и биологические особенности
Володушка золотистая (Bupleurum aureum) (рис. 6) относится к семейству Сельдерейных (Apiaceae Lindl). Для представителей рода характерен специфический сухой плод, расщепляющийся на два односемянных мерикарпия [81].
Рис. 6. Володушка золотистая
К роду принадлежат 200 видов, преимущественно распространенных в Северном полушарии – Евразии и Северной Африке. 15 видов описаны для Северной Америки и Южной Африки. В Турции распространены 46 видов, в Афганистане – 7, в Индии – 22, в Китае – 35, в Японии – 4. В России и сопредельных государствах насчитывают 56 видов (22 вида произрастают на Кавказе, 10 – в Западной Сибири, 9 – на Дальнем Востоке, 15 – в Средней Азии) [82].
Володушка золотистая – многолетнее поликарпическое растение. Стебель простой, гладкий, полый, крупный, тонкополосатый, высотою 25-150 см, одиночный или в верхней части слабоветвящийся. Прикорневые и нижние стеблевые листья продолговато-обратнояйцевидные, цельнокрайние, с резко выступающими жилками, к основанию суженные в узкий и длинный черешок; средние стеблевые листья в числе 7-11 – очередные, сидячие, продолговато-яйцевидные, туповато-заостренные, в основании с крупными ушками, почти стеблеобъемлющие; верхние стеблевые – более мелкие и широкие, сердцевидно-яйцевидные, почти пронзенные, самые верхние обычно желтоватые [83].
На нижней стороне листьев имеется сизоватый налет. Соцветие – сложный зонтик, который состоит из 5-14 (20) лучей. Мелкие зонтики снабжены обверткой из 3-5 крупных, в начале цветения зеленых, затем желтых или золотистых широкояйцевидных, почти округлых неравных листочков, похожих на верхние листья. Обверточки из 5, реже 8 лепестковидных, крупных ярко-желтых, тонких пленчатых листочков, производящих впечатление крупных цветков.
Ареал. Володушка золотистая широко распространена в лесах европейской части России (северо-восток и восток), на Урале, в Сибири, в Иркутской и Читинской областях, Монголии, в горах Джунгарского Алатау и Тянь-Шаня, Восточном Казахстане. Другой небольшой участок ареала примыкает к южной оконечности Байкала, охватывая район от Иркутска по побережью Байкала на юго-восток до низовий Селенги. В Средней Азии охватывает северные районы Киргизии и небольшой частью своего ареала заходит на территорию Монголии и Китая [82, 84].
Володушка золотистая широко распространена в южной части лесной и лесостепной зонах Красноярского края, в горно-лесном поясе и на субальпийских лугах Саян и Кузнецкого Алатау [74].
Применение в медицине. В сибирских видах Bupleurum обнаружены такие флавоноиды, как кверцетин, кемпферол, изорамнетин кверцетин-3-диглюкозид, рутинозид, тамариксетин, рутин, изокверцитрин, нарциссин, кверцитрин, антоцианы [85, 86].
Володушка является чрезвычайно ценным сырьем для получения лекарственных препаратов различного назначения. В нашей стране официнально сырье В. multinerve применяется для получения Р-витаминного препарата, известного под названием «Буплерин» (регистрационный номер 79/1041/1) и рекомендованного для профилактики и лечения заболеваний, сопровождающихся нарушением проницаемости сосудов [87, 88].
В течение многих лет сибирскими учеными проводятся исследования володушки золотистой как перспективного источника Р-витаминных средств [89]. В 1985 году из надземной части этого вида получен суммарный препарат, содержащий кверцетин, изорамнетин, рутин, нарциссин.
Различные виды растений рода Володушка обладают желчегонным, антисептическим, ранозаживляющим, жаропонижающим и противовоспалительным свойствами. Имеются указания на применение отваров при неврозах, как слабительное и детоксикационное при укусах змей [90].
2.3. Володушка козелецелистная – Bupleurum scorzoneraefolium Willd
Ботаническое описание и биологические особенности
Володушка козелецелистная (Bupleurum scorzoneraefolium) (рис. 7) – многолетнее травянистое растение с корнем обычной веретенообразной формы. Стебель отличается тем, что на нем находится мало веток, достигает длины до 50 см. Листья ланцетовидной формы, темно-зеленые, плоские. Лист имеет несколько прожилок, что делает его достаточно жестким. Цветки желтые или красновато-коричневые, обверточки малозаметны, собраны в мелкие сложные зонтики. Плоды – двусемянка.
Ареал. Вид распространен на Алтае, в Туве, а также в степных районах Красноярского края (известно более 130 местонахождений) [72], в Прибайкалье и Зауралье, реже в Приморье и Приамурье. Отдельные фрагменты ареала отмечены в Монголии и Китае [73].
Применение в медицине. Володушка козелецелистная содержит аскорбиновую кислоту, каротин, флавоновые гликозиды и сапонины, дубильные вещества и эфирные масла [72], часто применяется в сложных рецептах в традиционной медицине стран Азии в качестве тонизирующего и общеукрепляющего средства. Корни володушки козелецелистной в китайской и корейской медицине используют при импотенции, а также как мочегонное и противовоспалительное средство [90]. Работами сибирских ученых выявлено желчегонное и сокогонное действие надземных частей B. scorzonerifolium на желудок, поджелудочную железу и печень [85].
Рис. 7. Володушка козелецелистная
2.4. Чистотел большой – Chelidonium majus L
Ботаническое описание и биологические особенности.
Чистотел большой (Chelidonium majus L.) (рис. 8) семейства Маковые (Papaveraceae) является многолетним травянистым растением с коротким корневищем, от которого отрастают несколько корней и отходит один или несколько стеблей [91, 92].
Рис. 8. Чистотел большой
Корни короткие стержневые разветвленные, снаружи красно-бурые, внутри желто-оранжевые. Стебли ребристые до 100 см, сверху разветвленные, прямостоящие, голые или ветвистые снизу, с листьями снизу голыми или слегка опушенными, лирообразноперисторассеченными с небольшими городчато-лопастными сегментами. Прикорневые листья имеют недлинные черешки и иногда бывают опушены. В середине стеблей, а также в корневищах, корнях и листьях есть млечники, которые при срезании или срывании частей зеленого растения выделяют млечный сок желто-оранжевого цвета. Цветы у растения находятся на длинных цветоносах. Цветоносы собраны по 3–8 шт. в простые зонтики. Цветы правильные с четырьмя лепестками золотисто-желтого цвета длиной 8–16 мм. Цветет растение в мае–июне, порой, преимущественно в дождливое лето, цветение чистотела может продолжаться даже до сентября. Плоды созревают осенью и имеют вид стручочковидной двухстворчатой коробочки, в которой находится большое количество семян. Семена мелкие, черные, с блеском, яйцевидной формы. Масса 1000 семян 6–8 г [91].
Чистотел большой является непостоянным растением, внешний вид которого в зависимости от места произрастания может частично видоизменяться. В частности, в европейских странах чистотел имеет сильно изрезанные листья и заостренные лепестки цветков, а у чистотела, растущего в южных районах Сибири, все части стебля более вытянуты.
Ареал. Чистотел большой имеет типичный евро-азиатский ареал произрастания. Он занимает центральную, восточную и северную территорию Европы. В Европейской России и на Урале северная граница ареала растения доходит до арктической зоны [73].
Как дикорастущий сорняк чистотел широко распространен по всей территории Украины, кроме высокогорья Карпат. Растет одиночно или небольшими группами. Растение также встречается в разных растительных ассоциациях, в частности в светлых и тенистых широколистных лесах среди кустарников, реже – в светлых хвойных лесах, в рощах и прибрежных кустарниках.
В Красноярском крае растение распространено в южной лесостепной и лесной зонах, северная граница – до 62-й параллели. Растет на сорных местах, по обочинам дорог, на каменных осыпях по долине реки Енисей [74].
Применение в медицине. Галеновые препараты чистотела обладают спазмолитическим эффектом, блокируя ацетилхолинэстеразу, что позволяет их использовать при лечении бронхиальной астмы. Препараты чистотела также имеют выраженное противомикробное действие, обладают антибактериальными и противовирусными свойствами [93].
Фармакологическая активность большинства средств из чистотела обусловлена прежде всего наличием в нем алкалоидов, имеющих разную фармакологическую активность [94]. Основным алкалоидом, выделенным из чистотела, является хелидонин. При изучении фармакологической активности хелидонина подтверждено, что данный алкалоид в опытах на лягушках действует подобно морфину с последующим параличом ЦНС. Кроме того, стимулирует функции поджелудочной железы, селезенки, мезентериальных лимфатических узлов, в том числе лимфоузлов внебрюшной полости при язвенной болезни желудка [95, 96].
Алкалоид гомохелидонин действует бактериостатически в отношении золотистого стафилококка в разведении 1:12500, а развитие туберкулезной палочки задерживает в разведении 1:100000. Алкалоид хелеретрин оказывает бактериостатическое действие на золотистый стафилококк в разведении 1:10000, а развитие туберкулезной палочки он задерживает в разведении 1:25000. Алкалоид сангвинарин также действует антибактериально на стафилококк и на некоторые грамположительные виды бактерий.
В экспериментах іn vivo и in vitro установлено, что препараты чистотела могут ингибировать штаммы таких микроорганизмов, как S. aureus, К. pneumoniae, Candida albicans, Epidermoph. floccosum, Tr. mentographytes, Tr. rubrum, Microsp. ganis, Asp. fumigatus. Активность препаратов чистотела в отношении вирусов выражается в способности ингибировать вирус герпеса, энцефаломиелита за счет блокирования синтеза протеинов оболочки вируса.
Противогрибковую активность препаратов чистотела можно приравнивать к действию таких препаратов, как нитрофунгин и микодецидин [95].
Pulsuz fraqment bitdi.
