Kitabı oxu: «Полный курс за 3 дня. Микробиология»

Тема 1. Введение в микробиологию

1. Предмет и задачи микробиологии

Микроорганизмы – наиболее древняя и самая распространенная форма организации жизни на Земле, что свидетельствует об их значительной роли в природе и жизни человека. Ученые подсчитали, что в биосфере обитает не менее 10³⁰ бактерий, а число вирусов и простейших вообще не поддается учету. Эти мельчайшие существа могут быть как растительного, так и животного происхождения. К ним относят бактерии, вирусы, грибы, простейшие и микроводоросли. Общей характерной особенностью этих микроорганизмов является их микроскопический размер. Но все они имеют особенное происхождение, определенное строение и формы жизнедеятельности, при этом они всегда находятся в биоценотическом (от греч. bios – «жизнь» и coinos – «общий») отношении с другими живыми существами и неживой природой. При этом они состоят из структур, которые обеспечивают их жизненные процессы, направленные на выживание и размножение.

Микроорганизмы обусловливают круговорот веществ и энергии в природе, осуществляют расщепление органических веществ и синтез белка, обеспечивают плодородие почв и поддерживают газовый состав атмосферы и других природных процессов. Большое значение микроорганизмы играют в производственных процессах, связанных с получением необходимых для человека продуктов и материалов (например, хлебопечении, производстве органических кислот, ферментов, пищевых белков, гормонов, антибиотиков и других лекарственных веществ), а также в виноделии. Из вышеизложенного можно сделать вывод, что микроорганизмы играют важную роль в природе и жизни человека.

Изучение свойств «маленьких зверьков», как назвал микроорганизмы А. Левенгук, позволило выделить среди них безвредные и даже полезные для организма человека и оказывающие неблагоприятное влияние на человеческий организм. Первые – непатогенные, или сапрофиты, питаются органическими веществами от отмерших организмов. Они населяют кожу и слизистые оболочки, желудочно-кишечный и урогенитальный тракты, таким образом составляя экологическое единство с организмом человека и поддерживая постоянство некоторых процессов его жизнедеятельности. Вторые – патогенные – живут и питаются за счет органических субстратов, вызывают у человека различные заболевания и патологические процессы. При снижении сопротивляемости организма сапрофиты могут вызывать болезни и в этом случае ведут себя как патогенные микроорганизмы, и их называют условно-патогенными.

Микроорганизмы изучает наука микробиология.

Микробиология – наука, предметом изучения которой являются микроскопические существа, невидимые вооруженным взглядом и называемые микроорганизмами, их биологические признаки, систематика, экология, взаимоотношения с другими организмами.

Как самостоятельная наука микробиология сформировалась только во второй половине XIX в., и этому поспособствовал ряд гениальных открытий великого французского ученого Луи Пастера (роль микробов в круговороте веществ в природе, в процессах гниения и брожения и т. д.), хотя микроорганизмы были открыты уже в конце XVII в. Наличие в природе невидимых существ предполагали уже очень давно. Так, еще в VI в. до н. э. Гиппократ высказывал предположение о том, что причиной любой заразной болезни является невидимый человеческому глазу организм. Но в то время свое предположение он не мог доказать по естественным причинам. Зато это смог подтвердить А. Левенгук, который, смастерив первый в мире простейший микроскоп, обнаружил мельчайшие организмы в дождевой воде, зубном налете и других материалах и описал их.

С того времени микробиология шагнула далеко вперед, так как для изучения микроорганизмов перед ней открылись широкие возможности использования методов и технологий других наук, например физики и биологии, биоорганической химии, генетики, цитологии, иммунологии и молекулярной биологии. При этом перед микробиологией увеличилось и количество задач, которые не могут быть решены в пределах одной научной дисциплины и специалистами одного профиля. В связи с этим произошла дифференциация микробиологии на самостоятельные научные дисциплины. Теперь микробиология подразделяется на общую и частную. При этом общая микробиология изучает закономерности строения и жизнедеятельности микроорганизмов на молекулярном, клеточном и популяционном уровнях; генетику и взаимоотношения их с окружающей средой. Частная микробиология изучает отдельных представителей микромира в зависимости от их проявлений и влияний на окружающую среду. Частными разделами микробиологии являются медицинская, ветеринарная, сельскохозяйственная, техническая (раздел биотехнологии), морская и космическая микробиология.

Медицинская микробиология занимается изучением патогенных для человека микроорганизмов и в зависимости от их природы делится на бактериологию, вирусологию, микологию и протозоологию. При этом каждая дисциплина проводит микроскопические и другие виды исследований, а также изучает физиологические и генетические особенности патогенных микроорганизмов; роль микроорганизмов в этиологии и патогенезе инфекционных болезней; основные клинические проявления и распространенность вызываемых ими заболеваний; специфическую диагностику, профилактику и лечение заболеваний, вызванных патогенными микроорганизмами; экологию патогенных микроорганизмов.

Медицинская микробиология подразделяется на санитарную, клиническую и фармацевтическую микробиологию.

Предметом изучения санитарной микробиологии являются санитарно-микробиологическое состояние объектов окружающей среды и пищевых продуктов, разработка санитарных нормативов.

Предметами изучения клинической микробиологии являются определение роли условно-патогенных микроорганизмов в возникновении заболеваний человека, а также диагностика и способы профилактики этих болезней.

Предметом изучения фармацевтической микробиологии являются инфекционные болезни лекарственных растений и их порча под действием микроорганизмов; обсеменение лекарственных средств в процессе их изготовления и уже готовых лекарственных форм; методы асептики, антисептики, дезинфекции при производстве лекарственных средств; технология получения микробиологических и иммунологических диагностических, профилактических и лечебных препаратов.

Ветеринарная микробиология изучает возбудителей заболеваний животных, разрабатывает методы их биологической диагностики, специфической профилактики и этиотропного лечения, направленного на уничтожение микробов-возбудителей в организме больного животного.

Сельскохозяйственная микробиология занимается изучением микроорганизмов, которые участвуют в круговороте веществ, используются для приготовления удобрений, вызывают заболевания растений и др.

Основной задачей технической микробиологии является разработка биотехнологии синтеза микроорганизмами биологически активных веществ: белков, ферментов, витаминов, спиртов, органических веществ, антибиотиков и др.

Морская микробиология изучает микрофлору морей и водоемов.

Космическая микробиология изучает микрофлору космического пространства и других планет; влияние космических условий на свойства микроорганизмов и микрофлору организма человека. Эта дисциплина также разрабатывает методы предупреждения заноса микробов с поверхности Земли в космос и ряд других проблем.

Многочисленные открытия в микробиологии, изучение свойств и взаимоотношений между макро– и микроорганизмами способствовали развитию иммунологии. Эта наука доказала, что иммунная система организма служит для его защиты не только от микробных агентов, но и от любых генетически чужеродных ему веществ с целью сохранения постоянства внутренней среды в нем. Поэтому на основе достижений в иммунологии стали разрабатываться лабораторные методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных и неинфекционных заболеваний, а также иммунологические препараты, к которым относятся вакцины, иммуноглобулины, аллергены, диагностические препараты и др.

Таким образом, современная микробиология играет важную роль в диагностике, профилактике и лечении инфекционных и неинфекционных болезней.

2. Систематика и номенклатура микроорганизмов

В процессе изучения микроорганизмы были систематизированы по сходству и различиям, а также по взаимоотношениям между собой. Наука, изучающая принципы классификации, называется таксономией, что в переводе с греческого означает «расположение, порядок». Таксоном называют группу организмов, объединенных по определенным однородным свойствам в рамках той или иной таксономической категории. Такими категориями являются: царство – самая крупная токсономическая категория; далее следуют: подцарство, отдел, класс, порядок, семейство, род, вид, подвид и другие более мелкие категории.

Таксономия микроорганизмов основана на их морфологических, физиологических, биохимических и молекулярно-биологических свойствах.

Согласно современной систематике все микроорганизмы относятся к трем царствам: Vira – вирусы; Eucaryotae – простейшие и грибы; Procaryotae – преимущественно одноклеточные микроорганизмы.

Прокариоты отличаются от эукариотов тем, что не имеют морфологически оформленного ядра, сетчатого аппарата Гольджи, эндоплазматической сети, митохондрий, их рибосомы имеют константу седиментации 70S.

Для названия микроорганизмов в микробиологии была принята бинарная номенклатура, включающая родовое и видовое название. Название рода основывается на морфологическом признаке соответствующего микроорганизма или является производной от фамилии открывшего или изучившего данный микроорганизм. Видовое название связано с наименованием основного вызываемого этим микроорганизмом заболевания или основным местом обитания. При этом если видовую принадлежность микроорганизма установить не удается (чаще при идентификации микроорганизмов с нетрадиционными условиями существования и пищевыми потребностями), но определена принадлежность к роду, то употребляется термин «species».

Царство прокариотов состоит из двух отделов: цианобактерии (Cyanobacteria) – непатогенные микроорганизмы, обитающие во внешней среде (их медицинская микробиология не изучает); бактерии (Bacteria) – различные микробы, обитающие во внешней среде, а также в организме человека и животных, при этом медицинская микробиология изучает среди них патогенные микробы.

В свою очередь отделы подразделяются на порядки: собственно бактерии; актиномицеты; спирохеты; риккетсии; хламидии; микоплазмы.

Поскольку бактерии, являясь преимущественно одноклеточными микроорганизмами, способны образовывать ассоциации, или группы, сходных клеток, характеризующиеся клеточными, но не организменными свойствами, то порядки подразделяют на группы. Всего их 19, причем первые четыре из них являются непатогенными для организма человека:

1) фототрофные бактерии;

2) скользящие бактерии;

3) бактерии, образующие слизистую оболочку;

4) почкующиеся и (или) стебельковые бактерии;

5) спирохеты;

6) спиралевидные и изогнутые бактерии;

7) грамотрицательные аэробные палочки и кокки;

8) грамотрицательные факультативно-анаэробные палочки;

9) грамотрицательные анаэробные бактерии;

10) грамотрицательные кокки и коккобациллы;

11) грамотрицательные анаэробные кокки;

12) грамотрицательные хемолитотрофные бактерии;

13) метанобразующие бактерии;

14) грамположительные кокки;

15) палочки и кокки, образующие эндоспоры;

16) грамположительные аспорогенные палочковидные бактерии;

17) актиномицеты и родственные организмы;

18) риккетсии;

19) микоплазмы.

Чтобы отнести выделенный штамм бактерий к какой-либо группе, следует определить морфологию микробных клеток; отношение к окраске по Грамму; тип биологического окисления; способность к спорообразованию.

На основании изучения биохимических свойств бактерий происходит дальнейшая дифференциация групп на семейства, роды и виды.

Основной таксономической единицей систематики бактерий является вид.

Вид – это эволюционно сложившаяся совокупность особей, имеющая единый генотип, который в стандартных условиях проявляется сходными морфологическими, физиологическими, биохимическими и другими признаками.

Таким образом, для видовой идентификации бактерий необходимо знать следующие их свойства:

1) морфологические (форму и структуру бактериальной клетки);

2) тинкториальные (способность окрашиваться различными красителями);

3) культуральные (характер роста на питательной среде);

4) биохимические (способность утилизировать различные субстраты);

5) антигенные.

Вид не является конечной единицей систематики. Внутри вида выделяют варианты микроорганизмов, отличающиеся отдельными признаками. Так, выделенная из определенного источника и имеющая отличные от других представителей данного вида признаки чистая культура микроорганизмов называется штаммом. Это понятие является более узким, чем вид или подвид, а близким к нему является понятие клона, который представляет собой совокупность потомков, выращенных из единственной микробной клетки.

В зависимости от характера наследственных свойств среди микроорганизмов различают:

1) серовары (по антигенной структуре);

2) хемовары (по чувствительности к химическим веществам);

3) фаговары (по чувствительности к фагам);

4) ферментовары;

5) бактериоциновары;

6) бактериоциногеновары.

Бактериоцины – вещества, продуцируемые бактериями и губительно действующие на другие бактерии. По типу продуцируемого бактериоцина различают бактериоциновары, а по чувствительности – бактерициногеновары.

В настоящее время для систематики микроорганизмов используется ряд таксономических систем.

1. Нумерическая таксономия. Признает равноценность всех признаков. Для ее применения необходимо иметь информацию о многих десятках признаков. Видовая принадлежность устанавливается по числу совпадающих признаков.

2. Серотаксономия. Изучает антигены бактерий с помощью реакций с иммунными сыворотками. Наиболее часто применяется в медицинской бактериологии. Недостаток – бактерии не всегда содержат видоспецифический антиген.

3. Хемотаксономия. Применяются физико-химические методы, с помощью которых исследуется липидный, аминокислотный состав микробной клетки и ее определенных компонентов.

4. Генная систематика. Основана на способности бактерий с гомологичными ДНК к трансформации, трансдукции и конъюгации, на анализе внехромосомных факторов наследственности – плазмид, транспозонов, фагов.

Совокупность основных биологических свойств бактерий можно определить только у чистой культуры – это бактерии одного вида, выращенные на питательной среде.

3. Питательные среды и методы выделения чистых культур

Для культивирования бактерий используют питательные среды, к которым предъявляется ряд требований.

1. Питательность. Среды должны быть легкоусвояемыми и обязательно содержать углерод, азот, кислород и водород в виде минеральных или органических соединений, неорганические соединения различных солей и факторы роста.

2. Изотоничность. Для поддержания осмотического давления среды должны содержать определенную концентрацию хлорида натрия.

3. Оптимальный рН (кислотность) среды. Кислотность среды обеспечивает функционирование ферментов бактерий; для большинства бактерий составляет 7,2–7,6.

4. Оптимальный электронный потенциал, свидетельствующий о содержании в среде растворенного кислорода. Он должен быть высоким для аэробов и низким для анаэробов.

5. Прозрачность (чтобы был виден рост бактерий, особенно для жидких сред).

6. Стерильность (чтобы не было других бактерий).

Поскольку бактерии обладают различными свойствами, то для их выращивания и изучения требуется достаточно большое количество питательных сред, которые бы имели различное происхождение, состав, консистенцию и назначение. Поэтому была введена классификация питательных сред.

Классификация питательных сред

I. По происхождению:

1) естественные (молоко, желатин, картофель и др.);

2) искусственные – среды, приготовленные из специально подготовленных природных компонентов (пептона, аминопептида, дрожжевого экстракта и т. п.);

3) синтетические – среды известного состава, приготовленные из химически чистых неорганических и органических соединений (солей, аминокислот, углеводов и т. д.).

II. По составу:

1) простые – мясопептонный агар, мясопептонный бульон, агар и бульон Хоттингера и др.;

2) сложные – это простые с добавлением дополнительного питательного компонента (кровяного, шоколадного агара): сахарный бульон, желчный бульон, сывороточные агар и бульон, желточно-солевой агар, среда Китта-Тароцци, среда Вильсона-Блера и др.

III. По консистенции:

1) твердые (содержат 3–5 % агар-агара);

2) полужидкие (0,15–0,7 % агар-агара);

3) жидкие (не содержат агар-агара).

IV. По назначению:

1) общего назначения – универсальные – предназначены для культивирования большинства бактерий, так как содержат питательные вещества, в присутствии которых растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий (мясопептонный агар, мясопептонный бульон, кровяной агар). Тем не менее из-за большого разнообразия бактерий и их питательных потребностей создать такую универсальную питательную среду, чтобы она была пригодна для культивирования любых бактерий, практически невозможно;

2) специального назначения применяются для выращивания бактерий, не способных размножаться на универсальных средах:

а) элективные – среды, на которых растут бактерии только одного вида (рода), а род других подавляется. Например, в щелочной пептонной воде и щелочном мясопептонном бульоне интенсивнее по сравнению с другими сопутствующими бактериями растет холерный вибрион. Показателен и пример избирательности питательных сред, содержащих определенные концентрации антибиотиков: на них развиваются только штаммы, обладающие устойчивостью к ним, антибиотикочувствительные культуры в этих средах погибают;

б) дифференциально-диагностические – среды, на которых рост одних видов бактерий отличается от роста других видов по тем или иным свойствам, чаще биохимическим (среды Эндо, Левина, Плоскирева и др.). Кроме того, к дифференциально-диагностическим средам относят и специальные среды, позволяющие определить способность бактерий утилизировать тот или иной субстрат (среды Гиса с углеводами и мясопептонный желатин служат для определения протеолитической активности микроорганизмов; среда Симмонса – для определения способности бактерий разлагать цитрат; среда Хью-Лейфсона используется для дифференцирования аэробных бактерий от факультативно-анаэробных и др.);

в) среды обогащения – среды, в которых происходит размножение и накопление бактерий-возбудителей какого-либо рода или вида, т. е. обогащение ими исследуемого материала (селенитовый бульон).

Для получения чистой культуры необходимо владеть методами выделения чистых культур.

Методы выделения чистых культур

Выделяют следующие методы.

1. Механическое разобщение на поверхности плотной питательной среды (метод штриха обжигом петли, метод разведений в агаре, распределение по поверхности твердой питательной среды шпателем, метод Дригальского).

2. Использование элективных питательных сред.

3. Создание условий, благоприятных для развития одного вида (рода) бактерий (среды обогащения).

Чистую культуру получают в виде колоний – это видимое невооруженным глазом, изолированное скопление бактерий на твердой питательной среде, представляющее собой, как правило, потомство одной клетки. Разные виды бактерий образуют колонии, которые одна от другой отличаются по форме, величине, прозрачности, характеру поверхности, высоте, цвету, консистенции.

Тема 2. Морфология и ультраструктура бактерий

1. Особенности строения бактериальной клетки. Основные органеллы и их функции

Отличия бактерий от других клеток

Выделяют следующие отличия:

1) бактерии относятся к прокариотам, т. е. не имеют обособленного ядра;

2) в клеточной стенке бактерий содержится особый пептидогликан – муреин;

3) в бактериальной клетке отсутствуют аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть, митохондрии;

4) роль митохондрий выполняют мезосомы – инвагинации цитоплазматической мембраны;

5) в бактериальной клетке много рибосом;

6) у бактерий могут быть специальные органеллы движения – жгутики;

7) размеры бактерий колеблются от 0,3–0,5 до 5–10 мкм.

По форме клеток бактерии подразделяются на:

1) шаровидные (кокковые) формы. Кокки имеют правильную сферическую форму или форму неправильного шара в виде почки или напоминают пламя свечи. В среднем кокки в диаметре составляют 0,5–1,5 мкм. В зависимости от взаиморасположения клеток относительно друг друга кокки делятся на микрококки с отдельным изолированным расположением; диплококки – сцепленные попарно; тетракокки – сцепленные по четыре; стрептококки – сцепленные в цепочку; сарцины – сцепленные по 8, 12, 16 и т. д.; стафилококки – сцепленные беспорядочно, внешним вводом напоминая виноградную гроздь;

2) палочковидные (или цилиндрические) формы бактерий. Длина палочки составляет 1–8 мкм, а размер в поперечнике – 0,5–2 мкм. Бактерии различаются по форме и бывают правильной и неправильной, изогнутой, цилиндрической формы; по размерам – мелкие, средние и крупные, причем длина может значительно превышать диаметр поперечника; по форме концов – обрубленные, закругленные, заостренные, утолщенные. Так же как и шаровидные бактерии, палочковидные делятся и по характеру взаиморасположения и бывают расположенными поодиночке, диплобактерии и диплобациллы, сцепленные попарно, а также стрептобактерии и стрептобациллы, сцепленные в цепочку;

3) извитые формы бактерий различаются по характеру и количеству завитков. Среди них различают вибрионы в виде изогнутых палочек или неполных завитков; спириллы с одним или несколькими завитками; спирохеты, которые делятся на лептоспиры – завитки с загнутыми крючкообразными концами (S-образная форма), боррелии – 4–12 неправильных завитков, трепонемы – 14–17 равномерных мелких завитков.

Стоит отметить, что размеры бактерий, так же как и их форма (хотя и реже), могут изменяться, и это происходит под влиянием окружающей среды, в том числе питательной среды, ее рН, температуры, лекарственного препарата и т. п., а также в зависимости от возраста культуры. При этом подобные изменения не наследуются и являются лишь модификациями.

Ультраструктура бактерий изучается с помощью электронно-микроскопических исследований, дифференциального ультрацентрифугирования и цитохимических методов.

В бактериальной клетке различают:

1) обязательные органеллы:

а) нуклеоид – ядерное вещество, распыленное в цитоплазме клетки. Не имеет ядерной мембраны, ядрышек. В нем локализуется ДНК, представленная двухцепочечной спиралью. Обычно замкнута в кольцо и прикреплена к цитоплазматической мембране. Содержит около 60 млн пар оснований. Это чистая ДНК, она не содержит белков гистонов. Их защитную функцию выполняют метилированные азотистые основания. В нуклеоиде закодирована основная генетическая информация, т. е. геном клетки. Наряду с нуклеоидом в цитоплазме могут находиться автономные кольцевые молекулы ДНК с меньшей молекулярной массой – плазмиды. В них также закодирована наследственная информация, но она не является жизненно необходимой для бактериальной клетки;

б) цитоплазму, которая представляет собой сложную коллоидную систему, состоящую из воды (75 %), минеральных соединений, белков, РНК и ДНК, которые входят в состав органелл нуклеоида, рибосом, мезосом, включений;

в) рибосомы, которые представляют собой рибонуклеопротеиновые частицы размером 20 нм, состоящие из двух субъединиц – 30 S и 50 S. Рибосомы отвечают за синтез белка. Перед началом синтеза белка происходит объединение этих субъединиц в одну – 70 S. В отличие от клеток эукариотов рибосомы бактерий не объединены в эндоплазматическую сеть;

г) цитоплазматическую мембрану, которая представляет собой сложный липидобелковый комплекс, располагающийся непосредственно под клеточной стенкой и ограничивающий протопласт клетки. Этот комплекс состоит из липидов (15–30 %), белков (50–70 %), углеводов (2–5 %) и РНК. В цитоплазматической мембране локализуются пермеазы и ферменты окислительного фосфорилирования и регулируется транспорт метаболитов и ионов; происходит выделение ферментов и токсинов; мембрана принимает участие в репликации ДНК нуклеотида и его делении; участвует в синтезе компонентов клеточной стенки, а у некоторых бактерий – и в спорообразовании.

Производными цитоплазматической мембраны клетки являются мезосомы, образующиеся путем ее инвагинации в цитоплазму. Они могут быть в виде концентрических мембран, пузырьков, трубочек, в форме петли. Мезосомы связаны с нуклеоидом и участвуют в делении клетки и спорообразовании;

д) клеточную стенку, которая представляет собой биогетерополимер – плотную структуру, окружающую протопласт клетки и придающую ей постоянную форму;

2) необязательные органеллы:

а) споры;

б) капсулы;

в) ворсинки (реснички, фимбрии);

г) жгутики.

Включения являются продуктами метаболизма микроорганизмов, которые располагаются в их цитоплазме и используются в качестве запасных питательных веществ. К ним относятся включения гликогена, крахмала, серы, полифосфата (волютина) и др.

2. Строение клеточной стенки и цитоплазматической мембраны

Клеточная стенка – прочное, упругое ригидное образование толщиной 150–200 ангстрем, окружающее протопласт клетки и являющееся одним из основных структурных элементов бактериальной клетки.

Выполняет следующие функции:

1) защитную, осуществление фагоцитоза;

2) регуляцию осмотического давления;

3) рецепторную;

4) принимает участие в процессах питания, деления клетки;

5) антигенную (определяется продукцией эндотоксина – основного соматического антигена бактерий);

6) стабилизирует форму и размер бактерий;

7) обеспечивает систему коммуникаций с внешней средой;

8) косвенно участвует в регуляции роста и деления клетки.

Клеточная стенка при обычных способах окраски не видна, но если клетку поместить в гипертонический раствор (при опыте плазмолиза), то она становится видимой.

Клеточная стенка вплотную примыкает к цитоплазматической мембране у грамположительных бактерий, у грамотрицательных бактерий клеточная стенка отделена от цитоплазматической мембраны периплазматическим пространством.

Клеточная стенка имеет два слоя:

1) наружный – пластичный;

2) внутренний – ригидный, состоящий из муреина.

В зависимости от содержания муреина в клеточной стенке различают грамположительные и грамотрицательные бактерии (по отношению к окраске по Грамму).

У грамположительных бактерий муреиновый слой составляет 80 % от массы клеточной стенки. По Грамму они окрашиваются в синий цвет. У грамотрицательных бактерий муреиновый слой составляет 20 % от массы клеточной стенки, по Грамму они окрашиваются в красный цвет.

У грамположительных бактерий наружный слой клеточной стенки содержит липопротеиды, гликопротеиды, тейхоевые кислоты, у них отсутствует липополисахаридный слой. Клеточная стенка выглядит аморфной, она не структурирована. Поэтому при разрушении муреинового каркаса бактерии полностью теряют клеточную стенку (становятся протопластами), не способны к размножению.

У грамотрицательных бактерий наружный пластический слой четко выражен, содержит липопротеиды, липополисахаридный слой, состоящий из липида А (эндотоксина) и полисахарида (О-антигена). При разрушении грамотрицательных бактерий образуются сферопласты – бактерии с частично сохраненной клеточной стенкой, не способные к размножению.

В зависимости от строения клеточной стенки все бактерии делятся на 4 отдела:

1) грациликуты – бактерии с тонкой клеточной стенкой, грамотрицательные (различные извитые, палочковидные, кокковые формы бактерий, а также риккетсии и хламидии);

2) фирмикуты – бактерии с толстой клеточной стенкой, грамположительные (палочковидные, кокковые формы бактерий, а также коринебактерии и микобактерии, актиномицеты);

3) тенерикуты – бактерии без ригидной клеточной стенки (микоплазмы);

4) мендозикуты – архебактерии с дефектной клеточной стенкой и особенным строением рибосом, мембран и рибосомальных РНК.

К клеточной стенке прилегает цитоплазматическая мембрана толщиной 5–7,5 нм. Она обладает избирательной проницаемостью, принимает участие в транспорте питательных веществ, выведении экзотоксинов, энергетическом обмене клетки, является осмотическим барьером, участвует в регуляции роста и деления, репликации ДНК, является стабилизатором рибосом.

Цитоплазматическая мембрана имеет трехслойную структуру и состоит из двух слоев липидов (25–40 %) со встроенными поверхностными и интегральными белками, пронизывающими структуру мембраны. В ее состав входят фосфолипиды, липопротеин, белки, небольшое количество углеводов и другие соединения. Стоит отметить, что липидный состав мембран непостоянен. Он может меняться в зависимости от условий культивирования и возраста культуры. Разные виды бактерий отличаются друг от друга по липидному составу своих мембран.

Цитоплазматическая мембрана по сути является разделительной перегородкой, через которую с помощью ферментов постоянно осуществляется активный транспорт различных веществ и ионов, являющихся жизненно необходимыми для клетки.

В клеточной мембране содержатся и высокочувствительные рецепторы, дающие возможность клетке идентифицировать сигналы, поступающие из окружающей среды, а также питательные вещества и различные антибактериальные соединения. Кроме того, на поверхности цитоплазматической мембраны находятся активные ферментные системы, которые принимают участие в синтезе белка, токсинов, ферментов, нуклеиновых кислот и других веществ, а также в окислительном фосфорилировании.

В случае избыточного роста относительно роста клеточной стенки цитоплазматическая мембрана образует инвагинаты, или выпячивания, представляющие собой либо сложно закрученные структуры – мезосомы, либо менее сложно закрученные структуры – внутрицитоплазматические мембраны. Хотя роль тех и других в жизнедеятельности клетки до конца не изучена, достоверно известно, что они играют немаловажную роль в образовании клеточных стенок и делении клетки, так как обеспечивают энергией синтез клеточной стенки, а также участвуют в секреции веществ и в спорообразовании, на которые затрачивается большое количество энергии.

3. Дополнительные органеллы бактерий

Дополнительными органеллами бактерий являются жгутики, ворсинки, капсулы и споры.

Жгутики – органеллы движения. Есть у подвижных грамположительных и грамотрицательных бактерий. Это особые белковые выросты, напоминающие собой тонкие спирально закрученные нити, исходящие от цитоплазматической мембраны и прикрепленные к клеточной стенке с помощью базального тела, которое состоит из целой системы дисков, соединяющих цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку. Жгутики располагаются на поверхности бактериальной клетки. Длина жгутиков составляет 3–12 мкм, а толщина – 12–20 нм. Количество и расположение жгутиков у разных бактерий неодинаковы. Например, монотрихи имеют лишь один жгутик, а лофотрихи – целый пучок, который располагается на одном полюсе клетки, амфитрихи имеют по одному жгутику на каждом конце, у перитрихов жгутики располагаются по всей поверхности.

Химический состав жгутиков определяется одним веществом – флагеллином – белком, обладающим антигенной специфичностью. Кроме того, жгутики бактерий нередко и сами имеют белковый чехол.

При окраске по Грамму жгутики не видны, поэтому о подвижности бактерий можно судить, рассматривая живые микроорганизмы, приготовленные в виде препаратов «висячая» или «раздавленная» капля, с помощью метода фазово-контрастной микроскопии, либо косвенно – по характеру роста в среде Пешкова (полужидком агаре). При этом неподвижные бактерии растут строго по уколу, а подвижные дают диффузный рост. Бактерии находятся в движении за счет вращательных движений жгутиков. Скорость движения бактерии зависит от особенностей расположения жгутиков и физико-химических свойств среды, при этом большое значение имеют ее вязкость, осмотическое давление и другие показатели. Таким образом, будет совершенно естественным, что бактерии, имеющие жгутики, расположенные термально, будут передвигаться гораздо быстрее, чем бактерии со жгутиками, расположенными по всей поверхности.

Что касается направления передвижения бактерии, то они передвигаются либо беспорядочно, либо путем направленного перемещения большинства клеток таксиса. Кроме ориентированного (таксиса) перемещения, различают хемотаксис, вызванный разницей в концентрации химических веществ в среде, а также аэротаксис, связанный с разницей в содержании кислорода, и фототаксис, при котором различие в освещенности является главным фактором направленного движения.

Ворсинки (пили, фимбрии) – более тонкие и короткие по сравнению со жгутиками полые нитевидные белковые выросты, являющиеся поверхностными придатками бактериальной клетки. Известно более 60 типов ворсинок, хотя наиболее изученными являются только два. В зависимости от типа ворсинок определяется их функция:

1) ворсинки первого типа (комон-пили) покрывают всю поверхность бактерии, которая с их помощью способна прикрепляться к клеткам макроорганизмов. Они характерны для грамположительных бактерий;

2) ворсинки второго типа (половые ворсинки, или секс-пили) участвуют в передаче генетического материала от одной клетки к другой при конъюгации бактерий, обеспечивая контакт между мужскими и женскими бактериальными клетками в процессе конъюгации. Через них идет обмен генетической информацией от донора к реципиенту. Донор – мужская клетка – обладает секс-пилями. Женская клетка – реципиент – не имеет секс-пилей. Белок секс-пили колируется генами F-плазмиды. Также эти ворсинки участвуют и в передаче и распространении лекарственной устойчивости бактерий.

Есть и еще один вид ворсинок, которые несут ответственность за питание и водно-солевой обмен в клетке.

Капсулы – поверхностные структуры большинства бактериальных клеток и представляют собой слизистое образование, которое в зависимости от толщины и строения образует микро– или макрокапсулу, прочно связанную с клеточной стенкой и имеющую четко очерченные внешние границы. Образование капсулы зависит от среды, в которой находится бактерия, она может быть утрачена клеткой с сохранением жизнеспособности. При этом капсулообразование является защитной функцией патогенной бактерии и предохраняет ее от фагоцитоза и других защитных механизмов макроорганизма.

Макрокапсулу можно выявить, используя специальные методы окраски, сочетая позитивные и негативные методы окраски. Как правило, капсула состоит из полисахаридов, реже полипептидов. Поскольку она обладает гидрофильностью, то препятствует фагоцитозу бактерии.

Микрокапсула обнаруживается только при электронной микроскопии и представляет собой утолщение верхних слоев клеточной стенки в виде слизистого образования.

Микрокапсулы характерны для вирулентных бактерий.

Среди бактерий различают:

1) истиннокапсульные бактерии (род Klebsiella) – сохраняют капсулообразование и при росте на питательных средах, а не только в макроорганизме;

2) ложнокапсульные – образуют капсулу только при попадании в макроорганизм.

Капсулы могут быть полисахаридными и белковыми. Они играют роль антигена, могут быть фактором вирулентности.

Внимательно изучая строение клетки, следует отличать слизь, покрывающую клетку, от капсулы. Слизь в отличие от макрокапсулы, как правило, не имеет четких внешних границ и представляет собой мукоидные экзополисахариды, которые участвуют в адгезии, или прилипании к субстратам. Известно, что экзополисахариды синтезируются самими бактериями путем секреции их компонентов или синтезируются при действии внеклеточных ферментов на дисахариды.

Совместными усилиями капсула и слизь играют защитную роль, предохраняя бактерию от повреждений, высыхания (этому способствуют их гидрофильные свойства) и препятствуя действию защитных факторов бактериофагов и макроорганизма.

Споры образуются внутри бактериальной клетки и представляют собой тельца округлой или овальной формы. Факторами образования спор являются обеднение питательной среды, изменение ее влажности и (или) кислотности, а также старение культуры, попадание вегетативных клеток в почву и иное, т. е. возникновение неблагоприятных условий существования для бактерий. Особенности строения и химический состав спор (низкое содержание воды, повышенное количество кальция и др.) обеспечивают им высокую устойчивость к действию физических и химических факторов, что затрудняет борьбу со спороносными патогенными бактериями, способными сохраняться во внешней среде длительное время. Спорообразование присуще грамположительным бактериям. В отличие от вегетативных форм споры более устойчивы к действию химических, термических факторов.

Чаще всего споры образуют бактерии рода Bacillus и Clostridium.

Процесс спорообразования заключается в утолщении всех оболочек клетки. Они пропитываются солями дипикалината кальция, становятся плотными, клетка теряет воду, замедляются все ее пластические процессы. При попадании споры в благоприятные условия она прорастает в вегетативную форму.

У грамотрицательных бактерий также обнаружена способность сохраняться в неблагоприятных условиях в виде некультивируемых форм. При этом нет типичного спорообразования, но в таких клетках замедленны метаболические процессы, невозможно сразу получить рост на питательной среде. Но при попадании в макроорганизм они превращаются в исходные формы.

Тема 3. Физиология бактерий

1. Рост и размножение бактерий

Жизнедеятельность бактерий в основном характеризуется их ростом и размножением.

Рост бактерий – увеличение бактериальной клетки в размерах без увеличения числа особей в популяции. Рост всегда предшествует размножению.

Размножение бактерий – процесс, обеспечивающий увеличение числа особей в популяции. Бактерии характеризуются высокой скоростью размножения, при этом она во многом зависит от видовой принадлежности бактерий и условий выращивания, которые включают в себя характер питательной среды, рН, температуру, аэрацию и др. Бактерии размножаются поперечным бинарным делением, при котором из одной материнской клетки образуются две одинаковые дочерние.

Процесс деления бактериальной клетки начинается с репликации хромосомной ДНК. В точке прикрепления хромосомы к цитоплазматической мембране (точке-репликаторе) действует белок-инициатор, который вызывает разрыв кольца хромосомы, и далее идет деспирализация ее нитей. Нити раскручиваются, и вторая нить прикрепляется к цитоплазматической мембране в точке-прорепликаторе, которая диаметрально противоположна точке-репликатору. За счет ДНК-полимераз по матрице каждой нити достраивается точная ее копия. Удвоение генетического материала – сигнал для удвоения числа органелл. В септальных мезосомах идет построение перегородки, делящей клетку пополам.

Двунитевая ДНК спирализуется, скручивается в кольцо в точке прикрепления к цитоплазматической мембране. Это является сигналом для расхождения клеток по септе. Образуются две дочерние особи.

На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток – колонии, видимые невооруженным глазом, различные по размерам, форме, поверхности, окраске, зависящей от пигмента бактерий, консистенции и т. д. Наиболее распространенными пигментами среди микроорганизмов являются меланины, каротины, ксантофиллы и другие, многие из которых обладают защитным, антимикробным, антибиотикоподобным эффектом. Вид, форма, цвет, консистенция и другие характерные особенности колоний учитываются при идентификации бактерий и отборе колоний для получения чистой культуры. При этом также следует учитывать, что внешний вид колоний характерен для определенных бактерий, но порой в большей степени зависит от условий культивирования.

На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности питательной среды, равномерного помутнения или осадка.

Размножение бактерий определяется временем генерации. Это период, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, состава питательной среды, температуры и др.

Фазы размножения бактериальной клетки на жидкой питательной среде:

1) начальная стационарная фаза; то количество бактерий, которое попало в питательную среду и в ней находится;

2) лаг-фаза (фаза покоя); продолжительность – 3–4 ч, происходит адаптация бактерий к питательной среде, начинается активный рост клеток, но активного размножения еще нет; в это время увеличивается количество белка, РНК;

3) фаза логарифмического размножения; активно идут процессы размножения клеток в популяции, размножение преобладает над гибелью;

4) максимальная стационарная фаза; бактерии достигают максимальной концентрации, т. е. максимального количества жизнеспособных особей в популяции; количество погибших бактерий равно количеству образующихся; дальнейшего увеличения числа особей не происходит;

5) фаза ускоренной гибели; процессы гибели преобладают над процессом размножения, так как истощаются питательные субстраты в среде. Накапливаются токсические продукты, продукты метаболизма. Этой фазы можно избежать, если использовать метод проточного культивирования: из питательной среды постоянно удаляются продукты метаболизма и восполняются питательные вещества.

Кроме размножения и роста, нормальная жизнедеятельность бактерий характеризуется и возрастной изменчивостью, т. е. способностью к изменению особей в разных стадиях роста, созревания и старения.

2. Питание бактерий

Под питанием понимают процессы поступления и выведения питательных веществ в клетку и из клетки. Питание в первую очередь обеспечивает размножение и метаболизм клетки. Стоит отметить, что бактериальные клетки не имеют специальных органов питания, поэтому являются голофитными.

Среди необходимых питательных веществ выделяют органогены – это девять химических элементов, концентрация которых в бактериальной клетке превосходит 10–4 моль. К ним относят углерод, кислород, водород, азот, фосфор, калий, магний, кальций, сера.

Кроме органогенов, необходимы микроэлементы. Они обеспечивают активность ферментов. Это цинк, марганец, молибден, кобальт, медь, никель, вольфрам, натрий, хлор.

Для бактерий характерно многообразие источников получения питательных веществ.

В зависимости от источника получения углерода бактерии делят на:

1) аутотрофы (используют неорганические вещества – СО₂ и не нуждаются в сложных органических соединениях);

2) гетеротрофы (используют в качестве источника углерода разнообразные органические углеродосодержащие соединения, которыми являются углеводы, углеводороды, аминокислоты и органические кислоты);

3) метатрофы (используют органические вещества неживой природы);

4) паратрофы (используют органические вещества живой природы).

Процессы питания должны обеспечивать энергетические потребности бактериальной клетки.

По источникам энергии микроорганизмы делят на:

1) фототрофы (способны использовать солнечную энергию);

2) хемотрофы (получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций);

3) хемолитотрофы (используют неорганические соединения);

4) хемоорганотрофы (используют органические вещества). Факторами роста бактерий являются витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, присутствие которых ускоряет рост.

Среди бактерий выделяют:

1) прототрофы (способны сами синтезировать необходимые вещества из низкоорганизованных);

2) ауксотрофы (являются мутантами прототрофов, потерявшими гены; ответственны за синтез некоторых веществ – витаминов, аминокислот, поэтому нуждаются в этих веществах в готовом виде).

Микроорганизмы ассимилируют питательные вещества в виде небольших молекул, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры могут служить источниками питания только после расщепления их экзоферментами до более простых соединений.

Метаболиты и ионы поступают в микробную клетку различными путями.

Пути поступления метаболитов и ионов в микробную клетку:

1) пассивный транспорт (без энергетических затрат):

а) простая диффузия;

б) облегченная диффузия (по градиенту концентрации, с помощью белков-переносчиков);

2) активный транспорт (с затратой энергии, против градиента концентрации; при этом происходит взаимодействие субстрата с белком-переносчиком на поверхности цитоплазматической мембраны).

Встречаются модифицированные варианты активного транспорта – перенос химических групп. В роли белков-переносчиков выступают фосфорилированные ферменты, поэтому субстрат переносится в фосфорилированной форме. Такой перенос химической группы называется транслокацией.

3. Метаболизм бактериальной клетки

Обмен веществ (метаболизм) по сути является совокупностью двух взаимосвязанных противоположных процессов – катаболизма (диссимиляции), который представляет собой распад веществ в процессе ферментативных реакций и накопления выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ, и анаболизма (ассимиляции), представляющего собой синтез веществ с затратой энергии.

Изучение обмена веществ у бактерий возможно с помощью применения физико-химических и биохимических методов исследования, которые проводятся в ходе культивирования бактерий в определенных условиях на специальных питательных средах, содержащих определенное соединение в качестве субстрата для трансформации.

Особенности метаболизма у бактерий:

1) многообразие используемых субстратов;

2) интенсивность процессов метаболизма;

3) направленность всех процессов метаболизма на обеспечение процессов размножения;

4) преобладание процессов распада над процессами синтеза;

5) наличие экзо– и эндоферментов метаболизма.

В процессе метаболизма выделяют два вида обмена:

1) пластический (конструктивный):

а) анаболизм (с затратами энергии);

б) катаболизм (с выделением энергии);

2) энергетический обмен (протекает в дыхательных мезосомах):

а) дыхание;

б) брожение.

В зависимости от акцептора протонов и электронов среди бактерий различают аэробы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы. Аэробы способны получать энергию только путем дыхания и постоянно нуждаются в молекулярном кислороде как конечном акцепторе электронов. Для них характерно окисление, при котором конечным акцептором электронов является кислород.

Облигатные анаэробы растут только в бескислородной среде или в среде с низким значением редокс-потенциала (Eh). Как тип окислительно-восстановительных процессов для них характерна ферментация с переносом электронов от субстрата-донора к субстрату-акцептору. Из этого можно сделать вывод, что для облигатных анаэробов характерно только брожение, в кислородных условиях наступает гибель микроорганизма из-за образования перекисей, идет отравление клетки.

Факультативные анаэробы способны расти как в присутствии кислорода, так и в его отсутствие, используя при этом в качестве терминальных акцепторов электронов молекулярный кислород или органические соединения. Кроме того, среди факультативных анаэробов встречаются бактерии, способные переключаться с окисления на ферментацию, а также такие бактерии, которые способны расти в присутствии атмосферного кислорода, при этом не используя его, а энергию получают исключительно с помощью брожения.

В микробной клетке ферменты являются биологическими катализаторами, отличающимися от других катализаторов исключительной эффективностью и высокой специфичностью как в отношении природы катализируемой реакции, так и в отношении структуры субстрата. Ферменты обеспечивают протекание реакций в физиологических условиях. Скорость этих реакций зависит от условий, в которых находится данный микроорганизм, в частности от температуры среды, ее рН и других факторов.

По строению среди ферментов выделяют:

1) простые ферменты (белки);

2) сложные; состоят из белковой (активного центра) и небелковой частей; необходимы для активизации ферментов.

Различают также:

1) конституитивные ферменты (синтезируются постоянно независимо от наличия субстрата);

2) индуцибельные ферменты (синтезируются только в присутствии субстрата).

Набор ферментов в клетке строго индивидуален для вида. Способность микроорганизма утилизировать субстраты за счет своего набора ферментов определяет его биохимические свойства.

Ферменты, образуемые микроорганизмами, могут локализоваться в различных частях клетки или быть связанными с ее иными структурами, также могут выделяться в окружающую среду. Поэтому по месту действия ферментов среди них выделяют:

1) экзоферменты – действуют вне клетки; принимают участие в процессе распада крупных молекул, которые не могут проникнуть внутрь бактериальной клетки; характерны для грамположительных бактерий;

2) эндоферменты – действуют в самой клетке, обеспечивают синтез и распад различных веществ.

В зависимости от катализируемых химических реакций все ферменты делят на шесть классов:

1) оксидоредуктазы (катализируют окислительно-восстановительные реакции между двумя субстратами);

2) трансферазы (осуществляют межмолекулярный перенос химических групп);

3) гидролазы (осуществляют гидролитическое расщепление внутримолекулярных связей);

4) лиазы (присоединяют химические группы по двум связям, а также осуществляют обратные реакции);

5) изомеразы (осуществляют процессы изомеризации, обеспечивают внутреннюю конверсию с образованием различных изомеров);

6) лигазы, или синтетазы (соединяют две молекулы, вследствие чего происходит расщепление пирофосфатных связей в молекуле АТФ).

Любой микроорганизм имеет свой ферментный состав, который определяется его геномом и является достаточно постоянным признаком. Поэтому определение ферментов имеет большое значение при дифференцировке и идентификации бактерий. При этом некоторые ферменты могут способствовать проявлению патогенных свойств различными возбудителями инфекционных болезней человека.

4. Виды пластического обмена

Основными видами пластического обмена являются:

1) белковый;

2) углеводный;

3) липидный;

4) нуклеиновый;

5) минеральный.

Белковый обмен характеризуется катаболизмом и анаболизмом. В процессе катаболизма бактерии разлагают белки под действием протеаз с образованием пептидов. Под действием пептидаз из пептидов образуются аминокислоты.

Распад белков в аэробных условиях называется тлением, в анаэробных – гниением.

В результате распада аминокислот клетка получает ионы аммония, необходимые для формирования собственных аминокислот. Бактериальные клетки способны синтезировать все 20 аминокислот. Ведущими из них являются аланин, глютамин, аспарагин. Они включаются в процессы переаминирования и трансаминирования. В белковом обмене процессы синтеза преобладают над распадом, при этом происходит потребление энергии.

В углеводном обмене у бактерий катаболизм преобладает над анаболизмом. Сложные углеводы внешней среды могут расщеплять только те бактерии, которые выделяют ферменты – полисахаридазы. Полисахариды расщепляются до дисахаров, которые под действием олигосахаридаз распадаются до моносахаров, причем внутрь клетки может поступать только глюкоза. Часть ее идет на синтез собственных полисахаридов в клетке, другая часть подвергается дальнейшему расщеплению, которое может идти по двум путям: по пути анаэробного распада углеводов – брожению (гликолизу) и в аэробных условиях – по пути горения.

В зависимости от конечных продуктов выделяют следующие виды брожения:

1) спиртовое (характерно для грибов);

2) пропионионово-кислое (характерно для клостридий, пропиони-бактерий);

3) молочно-кислое (характерно для стрептококков);

4) масляно-кислое (характерно для сарцин);

5) бутилденгликолевое (характерно для бацилл).

Наряду с основным анаэробным распадом (гликолизом) могут быть вспомогательные пути расщепления углеводов (пентозофосфатный, кетодезоксифосфоглюконатный и др.) Они отличаются ключевыми продуктами и реакциями.

Липидный обмен осуществляется с помощью ферментов – липопротеиназ, летициназ, липаз, фосфолипаз.

Липазы катализируют распад нейтральных жирных кислот, т. е. ответственны за отщепление этих кислот от глицерина. При распаде жирных кислот клетка запасает энергию. Конечным продуктом распада является ацетил-КоА.

Биосинтез липидов осуществляется за счет ацетилпереносящих белков. При этом ацетильный остаток переходит на глицерофосфат с образованием фосфатидных кислот, а они уже вступают в химические реакции с образованием сложных эфиров со спиртами. Эти превращения лежат в основе синтеза фосфолипидов.

Бактерии способны синтезировать как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты, но синтез последних более характерен для аэробов, так как требует кислорода.

Нуклеиновый обмен бактерий связан с генетическим обменом. Синтез нуклеиновых кислот имеет значение для процесса деления клетки. Синтез осуществляется с помощью ферментов: рестриктазы, ДНК-полимеразы, лигазы, ДНК-зависимые-РНК-полимеразы.

Рестриктазы вырезают участки ДНК, убирая нежелательные вставки, а лигазы обеспечивают сшивку фрагментов нуклеиновой кислоты. ДНК-полимеразы ответственны за репликацию дочерней ДНК по материнской. ДНК-зависимые-РНК-полимеразы отвечают за транскрипцию, осуществляют построение РНК на матрице ДНК.

Минеральный обмен важен для синтеза тела бактерий. Для него необходимы не только азот и углерод, но и зольные элементы – сера, фосфор, калий и кальций, а также микроэлементы – бор, молибден, цинк, марганец, кобальт, никель, йод, бром, медь и др. В состав цитоплазмы бактерий входит сера, которая участвует в синтетических реакциях в виде R-SH. Данная сера восстановленной формы обладает высокой реактивностью и легко поддается дегидрированию с последующим превращением в сложные соединения, которые при гидрировании восстанавливаются, благодаря чему регулируется окислительно-восстановительный потенциал в цитоплазме бактерии.

В нуклеиновых кислотах, многих ферментах, различных фосфолипидах и других органических соединениях содержится фосфор, который не вступает в непосредственное соединение с углеродом, но образует связи через атомы кислорода. В процессе окислительных реакций высвобождается энергия, аккумулированная в цитоплазме клеток. При этом большую роль в энергетическом обмене в клетке играют АТФ– и АДФ-кислоты. Кроме того, фосфор входит в состав нуклеопротеидов, фосфолипидов, простетических групп большинства двухкомпонентных ферментов, являющихся важнейшими соединениями цитоплазмы.

Для нормального развития микроорганизмов необходимы катионы и анионы многих металлов, в том числе магния, кальция, железа. Микроэлементы участвуют в синтезе ферментов и активизируют их.

Тема 4. Генетика микроорганизмов. Бактериофаги

1. Организация наследственного материала бактерий

ДНК является материальной основой наследственности, которая определяет генетические свойства всех организмов, за исключением РНК-содержащих вирусов, у которых вся генетическая информация записана в РНК.

Геном – фрагмент молекулы ДНК, контролирующий синтез одного белка или пептида. Генетическая информация относительно всех признаков, присущих клетке или вириону, записана в генах. Гены, несущие информацию о синтезируемых микроорганизмами ферментах или структурных белках, называются структурными генами, их транскрипции регулируются регуляторными генами.

Наследственный аппарат бактерий представлен одной хромосомой, которая представляет собой молекулу ДНК, она спирализована и свернута в кольцо. Это кольцо в одной точке прикреплено к цитоплазматической мембране. На бактериальной хромосоме располагаются отдельные гены.

Функциональными единицами генома бактерий, кроме хромосомных генов, являются:

1) IS-последовательности;

2) транспозоны;

3) плазмиды.

IS-последовательности – это короткие фрагменты ДНК. Они не несут структурных (кодирующих белок) генов, а содержат только гены, ответственные за транспозицию (способность перемещаться по хромосоме и встраиваться в различные ее участки).

Транспозоны – это более крупные молекулы ДНК. Помимо генов, ответственных за транспозицию, они содержат и структурный ген. Транспозоны способны перемещаться по хромосоме. Их положение сказывается на экспрессии генов. Транспозоны могут существовать и вне хромосомы (автономно), но неспособны к автономной репликации.

Плазмиды – дополнительный внехромосомный генетический материал. Представляет собой кольцевую, двунитевую молекулу ДНК, гены которой кодируют дополнительные свойства, придавая селективные преимущества клеткам. Плазмиды способны к автономной репликации, т. е. независимо от хромосомы или под слабым ее контролем. За счет автономной репликации плазмиды могут давать явление амплификации: одна и та же плазмида может находиться в нескольких копиях, тем самым усиливая проявление данного признака.

В зависимости от свойств признаков, которые кодируют плазмиды, различают:

1) R-плазмиды. Обеспечивают лекарственную устойчивость; могут содержать гены, ответственные за синтез ферментов, разрушающих лекарственные вещества, могут менять проницаемость мембран;

2) F-плазмиды. Кодируют пол бактерий. Мужские клетки (F+) содержат F-плазмиду, женские (F-) – не содержат. Мужские клетки выступают в роли донора генетического материала при конъюгации, а женские – реципиента. Они отличаются поверхностным электрическим зарядом и поэтому притягиваются. От донора переходит сама F-плазмида, если она находится в автономном состоянии в клетке.

F-плазмиды способны интегрировать в хромосому клетки и выходить из интегрированного состояния в автономное. При этом захватываются хромосомные гены, которые клетка может отдавать при конъюгации;

3) Col-плазмиды. Кодируют синтез бактериоцинов. Это бактерицидные вещества, действующие на близкородственные бактерии;

4) Tox-плазмиды. Кодируют выработку экзотоксинов;

5) плазмиды биодеградации. Кодируют ферменты, с помощью которых бактерии могут утилизировать ксенобиотики.

Потеря клеткой плазмиды не приводит к ее гибели. В одной и той же клетке могут находиться разные плазмиды.

2. Изменчивость бактерий

Различают два вида изменчивости – фенотипическую и генотипическую.

Фенотипическая изменчивость – модификации – не затрагивает генотип. Модификации затрагивают большинство особей в популяции. Они не передаются по наследству и с течением времени затухают, т. е. возвращаются к исходному фенотипу.

Генотипическая изменчивость затрагивает генотип. В основе ее лежат мутации и рекомбинации.

Мутации – изменение генотипа, сохраняющееся в ряду поколений и сопровождающееся изменением фенотипа. Особенностью мутаций у бактерий является относительная легкость их выявления.

По локализации различают мутации:

1) генные (точечные);

2) хромосомные;

3) плазмидные.

По происхождению мутации могут быть:

1) спонтанными, образующимися самопроизвольно и без видимого внешнего воздействия;

2) индуцированными, появляющимися в результате обработки микробной популяции мутагенными агентами, которыми могут быть: радиация, температурные, химические и другие воздействия, т. е. экспериментальным путем.

По направлению мутационного изменения мутации подразделяются на:

1) прямые – возникают в геноме «дикого типа» у бактерий в естественных условиях обитания. Образовавшиеся особи являются мутантами.

2) обратные (реверсионные) – мутации, завершающиеся возвратом от мутантного типа к дикому. Особи, возникшие в результате таких мутаций, называются реверентами. Реверсия может быть истинной в результате восстановления первоначального состояния мутантного гена; супрессорной, если реверсия происходит за счет дополнительной мутации.

Диссоциация – одна из форм мутации, в результате которой в популяции микроорганизмов возникают особи, отличающиеся от исходных внешним видом и структурой колоний, так называемые S-формы (круглые, влажные, с блестящей гладкой поверхностью и ровными краями) и R-формы (колонии неправильной формы, непрозрачные, сухие, с неровными краями и шероховатой поверхностью). S– и R-колонии являются крайними формами диссоциации, между которыми могут встречаться переходные формы. Диссоциация – явление генетической природы, оно связано с хромосомными мутациями генов, контролирующих синтез липополисахаридов клеточной стенки бактерий. Эта форма мутации известна у многих видов, возникает в природных условиях, но чаще выявляется в стареющих культурах.

Рекомбинации – это обмен генетическим материалом между двумя особями с появлением рекомбинантных особей с измененным генотипом.

У бактерий существует несколько механизмов рекомбинации:

1) конъюгация;

2) слияние протопластов;

3) трансформация;

4) трансдукция.

Конъюгация – обмен генетической информацией при непосредственном контакте донора и реципиента. Наиболее высокая частота передачи у плазмид, при этом плазмиды могут иметь разных хозяев. После образования между донором и реципиентом конъюгационного мостика одна нить ДНК-донора поступает по нему в клетку-реципиент. Чем дольше этот контакт, тем большая часть донорской ДНК может быть передана реципиенту.

Слияние протопластов – механизм обмена генетической информацией при непосредственном контакте участков цитоплазматической мембраны у бактерий, лишенных клеточной стенки.

Трансформация – передача генетической информации в виде изолированных фрагментов ДНК при нахождении реципиентной клетки в среде, содержащей ДНК-донора. Для трансдукции необходимо особое физиологическое состояние клетки-реципиента – компетентность. Это состояние присуще активно делящимся клеткам, в которых идут процессы репликации собственных нуклеиновых кислот. В таких клетках действует фактор компетенции – это белок, который вызывает повышение проницаемости клеточной стенки и цитоплазматической мембраны, поэтому фрагмент ДНК может проникать в такую клетку.

Эффективность трансформации зависит от физико-химических условий, а также физиологического состояния реципиентов и трансформирующей ДНК.

Трансдукция – это передача генетической информации между бактериальными клетками с помощью умеренных трансдуцирующих фагов. Трансдуцирующие фаги могут переносить один или более генов. Трансдукция бывает:

1) специфической (переносится всегда один и тот же ген, трансдуцирующий фаг всегда располагается в одном и том же месте);

2) неспецифической (передаются разные гены, локализация трансдуцирующего фага непостоянна).

3. Бактериофаги

Бактериофаги (фаги) – это вирусы, поражающие клетки бактерий. Они не имеют клеточной структуры, не способны сами синтезировать нуклеиновые кислоты и белки, поэтому являются облигатными внутриклеточными паразитами. Бактериофаги широко распространены в природе и находятся в воде, почве, пищевых продуктах, различных выделениях из организма людей и животных. Выявляются у большинства патогенных и непатогенных микроорганизмов.

Фаги различаются по форме, типу взаимодействия с микробной клеткой и специфичности.

Большинство фагов имеет форму головастика или сперматозоида, некоторые фаги имеют кубическую или нитевидную форму. Размеры колеблются от 20 до 800 нм у нитевидных фагов.

Фаги, напоминающие своим внешним видом головастиков, изучены наиболее полно. Под микроскопом отчетливо видно, что они состоят из вытянутой икосаэдрической головки и хвостового отростка, внутри которого имеется цилиндрический стержень, сообщающийся отверстием с головкой. Снаружи хвостовой отросток покрыт чехлом, который способен сокращаться наподобие мышцы. Заканчивается хвостовой отросток шестиугольной базальной пластинкой, имеющей короткие шипы с нитевидными структурами, называемыми фибриллами.

Химический состав фагов ограничивается двумя основными химическими компонентами: нуклеиновыми кислотами (ДНК или РНК) и белком. Двунитчатая ДНК плотно упакована в виде спирали внутри головки. Белки же входят в состав оболочки, окружающей нуклеиновую кислоту, и во все структурные элементы хвостового отростка. Структурные белки фага различаются по составу полипептидов и бывают в виде множества идентичных субъединиц, которые уложены по спиральному или кубическому типу симметрии. У некоторых фагов, кроме структурных белков, обнаружены геномные, или внутренние, белки, связанные с нуклеиновой кислотой, а также белки-ферменты, которые участвуют во взаимодействии фага с клеткой.

Фаги по сравнению с бактериями являются более устойчивыми к действию химических и физических факторов. Так, ряд дезинфицирующих веществ не оказывает существенного влияния на фаги, но отмечается их высокая чувствительность к формалину и кислотам. При температуре 65–70 °С наступает инактивация большинства фагов. При высушиваниии в запаянных ампулах, а также при замораживании в глицерине при температуре – 185 °С они способны сохраняться длительное время. Ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация вызывают их инактивацию, а в более низких дозах – мутацию.

Фаги могут существовать в двух формах:

1) внутриклеточной (это профаг, чистая ДНК);

2) внеклеточной (это вирион).

Фаги, как и другие вирусы, обладают антигенными свойствами и содержат группоспецифические и типоспецифические антигены.

Различают два типа взаимодействия фага с клеткой:

1) литический (продуктивная вирусная инфекция). Это тип взаимодействия, при котором происходит репродукция вируса в бактериальной клетке. Она при этом погибает. Вначале происходит адсорбция фагов на клеточной стенке. Затем следует фаза проникновения. В месте адсорбции фага действует лизоцим, и за счет сократительных белков хвостовой части в клетку впрыскивается нуклеиновая кислота фага. Далее следует средний период, в течение которого подавляется синтез клеточных компонентов и осуществляется дисконъюнктивный способ репродукции фага. При этом в области нуклеоида синтезируется нуклеиновая кислота фага, а затем на рибосомах осуществляется синтез белка. Фаги, обладающие литическим типом взаимодействия, называют вирулентными.

В заключительный период в результате самосборки белки укладываются вокруг нуклеиновой кислоты и образуются новые частицы фагов. Они выходят из клетки, разрывая ее клеточную стенку, т. е. происходит лизис бактерии;

2) лизогенный. Это умеренные фаги. При проникновении нуклеиновой кислоты в клетку идет интеграция ее в геном клетки, наблюдается длительное сожительство фага с клеткой без ее гибели. При изменении внешних условий могут происходить выход фага из интегрированной формы и развитие продуктивной вирусной инфекции.

Клетка, содержащая профаг в геноме, называется лизогенной и отличается от исходной наличием дополнительной генетической информации за счет генов профага. Это явление лизогенной конверсии.

По признаку специфичности выделяют:

1) поливалентные фаги (лизируют культуры одного семейства или рода бактерий);

2) моновалентные (лизируют культуры только одного вида бактерий);

3) типовые (способны вызывать лизис только определенных типов (вариантов) бактериальной культуры внутри вида бактерий).

Фаги могут применяться в качестве диагностических препаратов для установления рода и вида бактерий, выделенных в ходе бактериологического исследования. Однако чаще их применяют для лечения и профилактики некоторых инфекционных заболеваний. Умеренные фаги используются в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК в генной инженерии и биотехнологии.

Тема 5. Распространение микробов в природе и методы микробиологического контроля почвы, воды и воздуха

1. Микрофлора почвы

Плодородие почвы обеспечивается не только наличием в ней неорганических и органических веществ, но и различными видами микроорганизмов, которые обусловливают качественный состав почвы. Наиболее богаты микроорганизмами верхние слои почвы. Так, на глубине 5–15 см их содержится 1 000 000 в 1 мм³, но с увеличением глубины их число снижается, и на глубине 1,5 м и более можно встретить лишь единичные особи. Плотность микрофлоры особенно высока в черноземных, каштановых почвах, а также в хорошо удобряемых сероземах. Всего лишь 1 г плодородной почвы содержит несколько миллионов бактерий большинства известных к настоящему времени видов, миллион спор грибов, полсотни тысяч водорослей и четверть сотни тысяч простейших. Микрофлора плодородной почвы представлена микробными популяциями водорослей, актиномицетов, нитрифицирующих, денитрифицирующих, целлюлозоразлагающих бактерий, пигментных микробов, грибов, простейших, серобактерий, азотофиксирующих бактерий. Вместе с растениями и животными они составляют сложные и многообразные биогеноценозы, плотность и состав которых, а также функциональная активность и другие важные характеристики зависят прежде всего от типа и структуры почвы, от ее физико-химических показателей, в том числе от влажности и интенсивности инсоляции.

Почвенные микроорганизмы участвуют во всех процессах превращения веществ и энергии. При этом они осуществляют синтез биомассы и аккумуляцию энергии, биологическую фиксацию азота, брожение, гниение, нитрификацию и т. д. Так как все эти процессы протекают в природе с достаточно большой скоростью, то в результате происходит относительно быстрое превращение органических веществ в гумус, определяющий плодородие почвы.

Через почву могут передаваться возбудители многих инфекционных заболеваний, таких как столбняк, газовая гангрена, ботулизм.

Аспорогенные, патогенные и условно-патогенные бактерии, а также многие вирусы способны выживать в почве в течение от нескольких дней до нескольких месяцев, а споры возбудителей столбняка, сибирской язвы, анаэробной раневой инфекции могут сохраняться в течение многих лет. Кроме того, для возбудителей ботулизма, актиномикоза, глубоких микозов и микотоксикозов почва и вовсе является естественной средой обитания. Поэтому ранения кожных покровов, загрязненные землей, требуют безотлагательной профилактики с целью предупреждения развития раневой инфекции.

2. Микрофлора воды

Вода открытых морских и пресноводных водоемов, так же как и почва, является естественной средой обитания разнообразных бактерий, грибов, вирусов, микроскопических водорослей, простейших, также участвующих в циклах превращений соединений азота, углерода, серы, фосфора и других важных элементов. При этом отмечается обеднение микрофлорой грунтовых вод: в них содержатся лишь единичные микроорганизмы. Это объясняется их задержкой более верхними слоями почвы.

Так же как и в различных слоях почвы, состав микроорганизмов в различных слоях воды неодинаков и обусловлен степенью их адаптации к определенным условиям, включающим физико-химические условия, освещенность, степень растворимости кислорода и диоксида углерода, содержание органических и минеральных веществ и др. Этим обусловлены и различия в функциях микроорганизмов на поверхности воды и на дне водоема. Так, на поверхности воды микроорганизмы образуют пленку, в которой протекают процессы фотосинтеза. На дне, в иле, при наличии анаэробных условий активно протекают процессы гниения и брожения, хемоавтотрофного, метилтрофного и гетеротрофного синтеза.

Количественный и качественный состав микрофлоры воды также зависит от состава и концентрации минеральных и органических веществ, физико-химического состояния, рН среды, температуры и иных факторов. Так, в водоемах с низким содержанием органических соединений распространены сапрофитные микроорганизмы, не проявляющие требовательности к питательным субстратам. При повышенном содержании органических веществ в воде отмечается бурный рост популяции микроорганизмов, более требовательных к питательным веществам, что стимулирует их потребление простейшими, а это в свою очередь приводит к разрастанию водорослей с последующим явлением «цветения» воды.

В водах пресных водоемов встречаются кокковидные (микрококки), палочковидные (псевдомонады, аэромонады и др.) и извитые бактерии. При загрязнении воды органическими веществами увеличивается число анаэробных (особенно в иле на дне водоема) и аэробных бактерий, а также грибов. При этом микрофлора воды способна выполнять и роль активного фактора в процессе самоочищения воды от органических отходов, утилизирующихся микроорганизмами.

В отличие от тех возбудителей, которые могут находиться в почве, для водных источников характерна другая группа условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. К ним относят возбудителей заболеваний, имеющих водный путь передачи: лептоспироза, туляремии, гепатита А, острых кишечных инфекций (например, дизентерии, брюшного тифа и холеры, которые могут принимать характер водных эпидемий). Загрязнение водоемов данными видами микроорганизмов происходит в результате поступления в них фекально-бытовых сточных вод из прибрежных населенных пунктов, а также сточных вод животноводческих и птицеводческих хозяйств, попадания в воду трупов животных, погибших от различных инфекций. Таким образом, при массивном поступлении фекально-бытовых, а также ливневых и промышленных сточных вод в водоемах отмечается увеличение содержания заносных условно-патогенных и патогенных микробов. При этом, даже если в воде условия для их жизнедеятельности не являются благоприятными, они способны переживать их какое-то время. Сроки выживания во многом зависят от степени интенсивности процессов самоочищения воды и свойств самих микроорганизмов.

3. Микрофлора воздуха

Микрофлора воздуха во многом связана с микрофлорой почвы и воды, но тем не менее является самой непригодной для размножения микроорганизмов вследствие отсутствия питательных веществ, достаточного количества влаги и высушивания под солнечными лучами. Все эти факторы обусловливают быструю гибель микробов в воздухе. Эти же причины определяют видовой и численный состав микрофлоры атмосферного воздуха, ее вариабельность и динамичность. Большее количество микроорганизмов отмечается в воздухе больших населенных пунктов, меньшее – в воздухе сельской местности, над лесами, горами и морями.

Состав микрофлоры воздуха зависит от состава микрофлоры почвы, воды, времени года, климатических и метеорологических условий. Так, при достаточно высокой температуре и влажности воздуха микроорганизмов в нем гораздо больше, чем в сухом холодном воздухе. Чаще всего в воздухе находятся споровые формы бактерий и грибов; аспорогенные бактерии представлены чаще пигментообразующими видами.

Что касается воздуха закрытых помещений, то он может содержать и микрофлору верхних дыхательных путей и кожи человека. Обсемененность воздуха помещения во многом зависит от объема самого помещения, степени уборки, освещенности, частоты проветриваний, количества людей (и состояния их здоровья) в данном помещении, вида трудовой деятельности и других факторов.

Бактерии, вирусы и грибы попадают в воздух транзиторно в процессе жизнедеятельности человека (при разговоре, чиханьи, кашле) и сохраняются в воздухе в течение времени, достаточного для инфицирования находящихся в помещении людей. Так они становятся причиной заболеваний, передающихся воздушно-капельным путем. К таким заболеваниям относят: скарлатину, дифтерию, коклюш, туберкулез, стафилококковые инфекции, являющиеся бактериальными инфекциями, и грипп, парагрипп, корь и другие вирусные инфекции.

4. Санитарно-бактериологические исследования

Загрязнение объектов окружающей среды условно-патогенными и патогенными микроорганизмами представляет собой серьезную эпидемиологическую опасность. В связи с этим санитарно-бактериологические исследования приобретают важное практическое значение, так как позволяют оценить санитарно-гигиеническое состояние почвы, воды и воздуха. Эти исследования проводятся центрами государственного противоэпидемического надзора по следующим критериям:

1) общее микробное число (ОМЧ) – общее количество микроорганизмов в определенном объеме воздуха или воды;

2) наличие санитарно-показательных микроорганизмов – условно-патогенных микроорганизмов, присутствие которых в пробе свидетельствует о возможном загрязнении того или иного объекта патогенными бактериями, которые поражают те же органы и ткани или полости организма и животных, в которых обитают и эти условно-патогенные микроорганизмы. Кроме того, наличие санитарно-показательных организмов в объектах внешней среды является свидетельством загрязнения их экскретами человека или животных, а их количественный учет позволяет определить массивность загрязнения и степень эпидемической опасности объекта.

Почва

Кроме общего микробного числа, существуют два критерия состояния почвы:

1) присутствие бактерий группы кишечной палочки;

2) наличие патогенных и условно-патогенных энтеробактерий.

По общему микробному числу микроорганизмов на 1 г почвы делятся на:

1) чистые (до 10 000);

2) слабозагрязненные (до 100 000);

3) сильнозагрязненные (более 1 000 000).

Этот показатель важен для оценки пригодности земли для хозяйственных застроек, организации зон отдыха, охранных зон источников водоснабжения.

В качестве санитарно-показательных микроорганизмов почвы выбраны представители бактерий семейства Enterobacteriaceae, так как они являются представителями нормальной микрофлоры кишечника и так же, как и патогенные энтеробактерии – возбудители острых кишечных инфекций, не приспособлены к самостоятельному существованию, т. е. все представители этого семейства (патогенные и условно-патогенные), как правило, не размножаются в воде и не могут сохраняться в ней достаточно длительный срок; при этом многие из них имеют примерно одинаковую продолжительность выживания.

Санитарно-микробиологическое исследование почвы регламентируется МУ 2.1.7.730-99 «Гигиеническая оценка качеств почв населенных мест». В соответствии со схемой оценки эпидемической опасности почв населенных пунктов, приведенной в данном нормативном документе, загрязненной считается почва, содержащая бактерии группы кишечной палочки (БГКП) в количестве больше 10 клеток на 1 г почвы.

Питьевая вода

Санитарное состояние воды оценивается по таким критериям, как:

1) общее микробное число (ОМЧ). Для питьевой воды нормальным считается общее микробное число в 1 мл воды, не превышающее 100 КОЕ (колониеобразующих единиц)/мл. Для источников непитьевого водоснабжения и для открытых водоемов значение этого показателя значительно выше;

2) наиболее вероятное число колиформных бактерий (НВЧ) – грамотрицательных, не образующих спор палочек, не обладающих оксидазной активностью, ферментирующих лактозу или манит при температуре 37 °С в течение 24 ч (лактозоположительные кишечные палочки). НВЧ не должно быть больше 0,7 в 100 мл воды;

3) число термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ), обладающих всеми признаками колиформных бактерий, кроме этого, способных ферментировать лактозу до кислоты из газа при температуре 44 °С в течение 24 ч. Наличие термотолерантных колиформных бактерий является свидетельством свежефекального загрязнения воды.

Колиформные бактерии и термолатентные колиформные бактерии должны быть обнаружены более чем в 300 мл воды.

Бактерии семейства Enterobacteriaceae выбраны санитарно-показательными микроорганизмами воды по тем же причинам, что и для почвы.

Нормативными документами, регламентирующими санитарно-микробиологическое исследование воды, являются ГОСТ-18963073 и МУК 4.2.671-97 «Методы санитарно-микробиологического анализа питьевой воды».

Воздух

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха подразумевает изучение воздуха только тех или иных закрытых помещений по таким критериям, как:

1) общее микробное число в 1 м³ воздуха;

2) наличие в 1 м³ воздуха санитарно-показательных микроорганизмов, которыми в данном случае являются золотистый стафилококк и синегнойная палочка (последняя – только в воздухе медицинских учреждений хирургического профиля). Золотистый стафилококк является санитарно-показательным микроорганизмом в связи с тем, что в воздухе наряду с условно-патогенными и патогенными микроорганизмами, являющимися возбудителями широкого спектра инфекционных заболеваний, передающихся воздушно-капельным путем, чаще всего выявляются представители нормальной микрофлоры кожи и верхних дыхательных путей.

Стоит отметить, что золотистый стафилококк и синегнойная палочка являются основными возбудителями внутрибольничных инфекций, поэтому контроль бактериального загрязнения воздуха этими бактериями является одним из важнейших путей их профилактики.

Уровень микробной загрязненности воздуха лечебно-профилактических учреждений и специальных производств (по общему микробному числу) нормируется приказами Минздрава России и различными методическими рекомендациями. Посев воздуха с целью выделения возбудителей внутрибольничных инфекций производится по эпидемиологическим показаниям.

5. Роль микроорганизмов в круговороте веществ

Минерализация органических соединений растительного и животного происхождения до углерода, азота, серы, фосфора и иного происходит с помощью микроорганизмов.

Круговорот углерода протекает при активном участии в нем растений, водорослей, цианобактерий, которые фиксируют СО₂ в процессе фотосинтеза, а также при участии микроорганизмов, разлагающих органические вещества отмерших растений и животных с выделением СО₂. Аэробное разложение органических веществ сопровождается образованием СО₂ и воды, анаэробное брожение – кислотами, спиртами и СО₂.

Атмосферный азот связывают только клубеньковые бактерии и свободноживущие почвенные микроорганизмы. Псевдомонады, протей, бациллы, клостридии минерализуют органические соединения растительных, животных и микробных остатков, превращая их в соединения аммония. Этот процесс получил название аммонификации (или минерализации азота). Во время распада белков в присутствии кислорода образуются диоксид углерода, аммиак, сульфаты и вода, при отсутствии кислорода – аммиак, амины, диоксид углерода, органические кислоты, индол, скатол, сероводород. Наиболее усвояемыми для растений являются нитраты, или азотнокислые соли. Они появляются при распаде органических веществ в процессе окисления аммиака до азотистой, а впоследствии – и азотной кислоты. Этот процесс называется нитрификацией, а микроорганизмы, вызывающие его, – нитрифицирующими. Процесс нитрификации протекает в две фазы:

1) аммиак окисляется до азотистой кислоты с образованием нитритов. Этот процесс осуществляют бактерии рода нитрозомонас и др.;

2) азотистая кислота окисляется до азотной и превращается в нитраты. Этот процесс обеспечивают бактерии рода нитробактер и др.

Процесс нитрификации является примером взаимоотношений микроорганизмов, при которых один микроорганизм размножается, используя продукты жизнедеятельности другого микроорганизма.

Нитраты играют двоякую роль в плодородии почвы: с одной стороны они повышают плодородие, а с другой – в результате процесса денитрификации восстанавливаются с выделением свободного азота. Этот процесс обедняет запас азота в виде солей в почве, приводя тем самым к снижению ее плодородия.

Тема 6. Нормальная микрофлора организма человека

1. Нормальная микрофлора человека

Организм человека и населяющие его микроорганизмы являются единой экосистемой. Поверхности кожи и слизистых оболочек тела человека обильно заселены бактериями. При этом количество бактерий, населяющих покровные ткани (кожу, слизистые оболочки), во много раз превосходит число собственных клеток хозяина. Количественные колебания бактерий в биоценозе могут достигать для некоторых бактерий нескольких порядков и, тем не менее, укладываются в принятые нормативы.

Нормальная микрофлора человека – это совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенными взаимосвязями и местом обитания.

В организме человека в соответствии с условиями обитания формируются биотопы с определенными микробиоценозами. Любой микробиоценоз – это сообщество микроорганизмов, существующее как единое целое, связанное цепями питания и микроэкологией.

Виды нормальной микрофлоры:

1) резидентная – постоянная, характерна для данного вида. Количество характерных видов относительно невелико и относительно стабильно, хотя численно они всегда представлены наиболее обильно. Резидентная микрофлора обнаруживается в определенных местах тела человека, при этом важным фактором является его возраст;

2) транзиторная – временно попавшая, не характерная для данного биотопа; она активно не размножается, поэтому, хотя видовой состав транзиторных микроорганизмов и разнообразен, но они не являются многочисленными. Характерной особенностью этого вида микрофлоры является то, что, как правило, попадая на кожу или слизистые оболочки из окружающей среды, не вызывает заболеваний и не обитает постоянно на поверхностях тела человека. Она представлена сапрофитными условно-патогенными микроорганизмами, которые обитают на коже или слизистых оболочках в течение нескольких часов, дней или недель. Присутствие транзиторной микрофлоры определяется не только поступлением микроорганизмов из окружающей среды, но и состоянием иммунной системы организма хозяина, составом постоянной нормальной микрофлоры. Состав транзиторной микрофлоры не является постоянным и зависит от возраста, внешней среды, условий труда, рациона питания, перенесенных заболеваний, травм и стрессовых ситуаций.

Нормальная микрофлора формируется с рождения, и в это время на ее формирование оказывает влияние микрофлора матери и внутрибольничной среды, характер вскармливания. Заселение бактериями организма продолжается на протяжении всей его жизни. При этом качественный и количественный состав нормальной микрофлоры регулируется сложными антагонистическими и синергическими отношениями между отдельными ее представителями в составе биоценозов. Микробное обсеменение характерно для всех систем, имеющих контакты с окружающей средой. Тем не менее в норме многие ткани и органы здорового человека стерильны, в частности кровь, ликвор, суставная жидкость, плевральная жидкость, лимфа грудного протока, внутренние органы: сердце, мозг, паренхима печени, почек, селезенки, матка, мочевой пузырь, альвеолы легких. Стерильность в данном случае обеспечивается неспецифическими клеточными и гуморальными факторами иммунитета, препятствующими проникновению микробов в эти ткани и органы.

На всех открытых поверхностях и во всех открытых полостях формируется относительно стойкая микрофлора, специфичная для данного органа, биотипа или его участка.

Наибольшей обсемененностью характеризуются:

1) толстый кишечник. В составе нормальной микрофлоры преобладают анаэробные бактерии (96–99 %) (бактероиды, анаэробные молочнокислые бактерии, клостридии, анаэробные стрептококки, фузобактерии, эубактерии, вейлонеллы), аэробные и факультативно-анаэробные бактерии (1–4 %) (грамотрицательные колиформные бактерии – кишечная палочка, энтерококки, стафилококки, протеи, псевдомонады, лактобациллы, грибы рода Candida, отдельные виды спирохет, микобактерий, микоплазм, простейших и вирусов);

2) ротовая полость. Нормальная микрофлора разных отделов ротовой полости различна и определяется биологическими особенностями обитающих здесь видов. Представители микрофлоры ротовой полости делятся на три категории:

а) стрептококки, нейссерии, вейлонеллы;

б) стафилококки, лактобактерии, нитевидные бактерии;

в) дрожжеподобные грибы;

3) мочевыделительная система. Нормальная микрофлора наружной части уретры у мужчин и женщин представлена коринебактериями, микобактериями, грамотрицательными бактериями фекального происхождения и неспорообразующими анаэробами (это пептококки, пептострептококки, бактероиды). На наружных половых органах у мужчин и женщин локализуются микобактерии смегмы, стафилококки, микоплазмы и сапрофитные трепонемы;

4) верхние дыхательные пути. Собственная микрофлора носа состоит из коринебактерий, нейссерий, коагулазо-отрицательных стафилококков и α-гемолитических стрептококков; в качестве транзиторных видов могут присутствовать S. aureus, E. coli, β-гемолитические стрептококки. Микрофлора зева более разнообразна из-за смешивания микрофлоры полости рта и воздухоносных путей и состоит из: нейссерий, дифтероидов, α– и β-гемолитических стрептококков, энтерококков, микоплазм, коагулазо-отрицательных стафилококков, моракселл, бактероидов, боррелий, трепонем и актиномицетов. В верхних дыхательных путях преобладают стрептококки и нейссерии, встречаются стафилококки, дифтероиды, гемофильные бактерии, пневмококки, микоплазмы, бактероиды;

5) кожа, особенно ее волосистая часть. В связи с постоянным контактом с внешней средой кожа является местом обитания транзиторных микроорганизмов, при этом имея постоянную микрофлору, состав которой различен в разных анатомических зонах и зависит от содержания кислорода в окружающей бактерии среде, а также от близости к слизистым оболочкам, особенностей секреции и других факторов. Состав резидентной микрофлоры кожи и слизистых оболочек характеризуется наличием Staphylococcus epidermidis, S. aureus, Micrococcus spp., Sarcinia spp., Propionibacterium spp., коринеформными бактериями. В состав транзиторной микрофлоры входят: Streptococcus spp., Peptococcus cpp., Bacillus subtilis, Escherichia coli, Enterobacter spp., Acinebacter spp., Moraxella spp., Pseudomonadaceae, Lactobacillus spp., Nocardiodes spp., aspergillus spp., Candida albaicans.

Микроорганизмы, составляющие нормальную микрофлору, представляют собой четкую морфологическую структуру в виде биопленки – полисахаридного каркаса, состоящего из полисахаридов микробных клеток и муцина. В нем находятся микроколонии клеток нормальной микрофлоры. Толщина биопленки – 0,1–0,5 мм. В ней содержится от нескольких сотен до нескольких тысяч микроколоний, образующихся как из анаэробных, так и аэробных бактерий, соотношение которых в большинстве биоценозов составляет 10:1–100:1.

Формирование биопленки создает для бактерий дополнительную защиту. Внутри биопленки бактерии более устойчивы к действию химических и физических факторов.

Факторы, влияющие на состояние нормальной микрофлоры:

1) эндогенные:

а) секреторная функция организма;

б) гормональный фон;

в) кислотно-основное состояние;

2) экзогенные: условия жизни (климатические, бытовые, экологические).

Этапы формирования нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ):

1) случайное обсеменение слизистой. В ЖКТ попадают лактобациллы, клостридии, бифидобактерии, микрококки, стафилококки, энтерококки, кишечная палочка и др.;

2) формирование сети из ленточных бактерий на поверхности ворсинок. На ней фиксируются в основном палочковидные бактерии, постоянно идет процесс формирования биопленки.

2. Основные функции нормальной микрофлоры

Нормальная микрофлора рассматривается как самостоятельный экстракорпоральный орган с определенной анатомической структурой и следующими функциями.

1. Антагонистическая функция. Нормальная микрофлора обеспечивает колонизационную резистентность, т. е. устойчивость соответствующих участков тела (эпитопов) к заселению случайной, в том числе и патогенной, микрофлорой. Эта устойчивость обеспечивается как выделением веществ, оказывающих бактерицидное и бактериостатическое действие, так и конкуренцией бактерий за питательные субстраты и экологические ниши.

2. Иммуногенная функция. Бактерии, являющиеся представителями нормальной микрофлоры, постоянно поддерживают иммунную систему в должном состоянии своими антигенами.

3. Пищеварительная функция. Нормальная микрофлора принимает участие в полостном пищеварении за счет своих ферментов.

4. Метаболическая функция. Нормальная микрофлора участвует в обмене белков, липидов, уратов, оксалатов, стероидных гормонов, холестерина за счет своих ферментов.

5. Витаминообразующая функция. Как известно, в процессе метаболизма отдельные представители нормальной микрофлоры образуют витамины. Так, бактерии толстого кишечника синтезируют биотин, рибофлавин, пантотеновую кислоту, витамины К, Е, В₂, фолиевую кислоту, не всасывающиеся в толстом кишечнике, поэтому следует рассчитывать только на те из них, которые в небольшом количестве образуются в подвздошной кишке.

6. Детоксикационная функция. Нормальная микрофлора способна обезвреживать образующиеся в организме токсические продукты обмена веществ или организмы, попавшие из внешней среды, путем биосорбции или трансформации в нетоксичные соединения.

7. Регуляторная функция. Нормальная микрофлора участвует в регуляции газового, водно-солевого обмена, поддержании рН среды.

8. Генетическая функция. Нормальная микрофлора в этом случае является неограниченным банком генетического материала, так как обмен генетического материала постоянно происходит как между самими представителями нормальной микрофлоры, так и патогенными видами, попадающими в ту или иную экологическую нишу.

При этом нормальная микрофлора кишечника играет важную роль в конверсии желчных пигментов и желчных кислот, абсорбции питательных веществ и продуктов их расщепления. Ее представители продуцируют аммиак и другие продукты, которые могут адсорбироваться и участвовать в развитии печеночной комы.

3. Дисбактериоз

Дисбактериоз (дисбиоз) – это любые количественные или качественные изменения типичной для данного биотопа нормальной микрофлоры человека, возникающие в результате воздействия на макро– или микроорганизм различных неблагоприятных факторов.

Микробиологическими показателями дисбиоза служат:

1) снижение численности одного или нескольких постоянных видов;

2) потеря бактериями тех или иных признаков или приобретение новых;

3) повышение численности транзиторных видов;

4) появление новых, не свойственных данному биотопу видов;

5) ослабление антагонистической активности нормальной микрофлоры.

Причинами развития дисбактериоза могут быть:

1) антибиотико– и химиотерапия;

2) тяжелые инфекции;

3) тяжелые соматические заболевания;

4) гормонотерапия;

5) лучевые воздействия;

6) токсические факторы;

7) дефицит витаминов.

Дисбактериоз различных биотопов имеет различные клинические проявления. Дисбактериоз кишечника может проявляться в виде диареи, неспецифического колита, дуоденита, гастроэнтерита, хронических запоров. Дисбактериоз органов дыхания протекает в форме бронхитов, бронхиолитов, хронических заболеваний легких. Основными проявлениями дисбиоза ротовой полости являются гингивиты, стоматит, кариес. Дисбактериоз половой системы у женщин протекает как вагиноз.

В зависимости от выраженности этих проявлений различают несколько фаз дисбактериоза:

1) компенсированную, когда дисбактериоз не сопровождается какими-либо клиническими проявлениями;

2) субкомпенсированную, когда в результате дисбаланса нормальной микрофлоры возникают локальные воспалительные изменения;

3) декомпенсированную, при которой происходит генерализация процесса с возникновением метастатических воспалительных очагов.

Лабораторная диагностика дисбактериоза

Основной метод – бактериологическое исследование. При этом в оценке его результатов превалируют количественные показатели. Проводится не видовая идентификация, а только до рода.

Дополнительный метод – хроматография спектра жирных кислот в исследуемом материале. Каждому роду соответствует свой спектр жирных кислот.

Коррекция дисбактериоза:

1) устранение причины, вызвавшей дисбаланс нормальной микрофлоры;

2) использование эубиотиков и пробиотиков.

Эубиотики – это препараты, содержащие живые бактерициногенные штаммы нормальной микрофлоры (колибактерин, бифидумбактерин, бификол и др.).

Пробиотики – это вещества немикробного происхождения и продукты питания, содержащие добавки, стимулирующие собственную нормальную микрофлору. Стимулирующие вещества – олигосахариды, гидролизат казеина, муцин, молочная сыворотка, лактоферин, пищевые волокна.

Тема 7. Микрофлора растительного лекарственного сырья и микробиологический контроль лекарственных средств

1. Микрофлора растительного сырья

Обсеменение растительного лекарственного сырья микроорганизмами возможно несколькими путями:

1) в процессе обсеменения инфицирование происходит через воду, нестерильную аптечную посуду, воздух производственных помещений и руки персонала;

2) за счет нормальной микрофлоры растений и фитопатогенных микроорганизмов – возбудителей заболеваний растений, способных распространяться и заражать большое количество растений.

Эпифиты – микроорганизмы, развивающиеся в норме на поверхности растений, они не наносят вреда, являются антагонистами некоторых фитопатогенных микроорганизмов, растут за счет обычных выделений растений и органических загрязнений поверхности растений. Эпифитная микрофлора препятствует проникновению фитопатогенных микроорганизмов в растительные ткани, усиливая иммунитет растений. Наибольшее количество эпифитной микрофлоры составляют грамотрицательные бактерии Erwinia herbicola, они образуют золотисто-желтые колонии. Эти бактерии являются антагонистами возбудителя мягкой гнили овощей. Обнаруживают в норме и другие бактерии – Pseudomonas fluorescens, реже – Bacillus mesentericus и небольшое количество грибов. Микроорганизмы находятся не только на листьях, стеблях, но и на семенах растений. Нарушение поверхности растений и их семян способствует накоплению на них большого количества пыли и микроорганизмов. Состав микрофлоры растений зависит от вида, возраста растений, типа почвы и температуры окружающей среды. При повышении влажности численность эпифитных микроорганизмов возрастает, при понижении влажности – уменьшается.

Ризосфера – зона почвы около корней растений, где содержится значительное количество микроорганизмов. В ней часто присутствуют неспорообразующие бактерии (псевдомонады, микобактерии и др.), актиномицеты, спорообразующие бактерии и грибы. Они переводят различные субстраты в соединения, доступные для растений, синтезируют биологически активные соединения, вступают в симбиотические взаимоотношения с растениями, обладают антагонистическими свойствами против фитопатогенных бактерий.

Ризоплана – поверхность корня растений. В ней в большей степени, чем в ризосфере, представлены псевдомонады.

Микориза – симбиоз мицелия грибов с корнями высших растений. Она улучшает рост растений.

Растения окультуренных почв в большей степени загрязнены микроорганизмами, чем растения лесов и лугов. В нижней прикорневой части растений содержится особенно много микроорганизмов. Это явление связано с попаданием микроорганизмов из почвы. В большом количестве обнаруживаются микроорганизмы на растениях, растущих на орошаемых полях, свалках, вблизи складирования навоза, в местах выпаса скота. При этом растения могут загрязняться патогенными микроорганизмами и при неправильной заготовке могут быть хорошей питательной средой для размножения микроорганизмов. Одним из способов, препятствующих их росту на растениях, является процесс высушивания растений.

Фитопатогенными микроорганизмами являются следующие.

1. Бактерии. Болезни, вызываемые бактериями, называют бактериозами. Среди возбудителей бактериозов встречаются псевдомонады, микобактерии, коринебактерии, агробактерии и др. К бактериозам относятся различные виды гнилей, некрозы тканей.

Бактериозы различают:

1) общие: вызывают гибель всего растения или его отдельных частей и проявляются на корнях (корневые гнили) или в сосудистой системе растений;

2) местные: ограничиваются поражением отдельных участков растений, проявляясь на паренхимных тканях.

Передача возбудителей бактериозов происходит через зараженные семена, остатки больных растений, почву, воду, воздух, путем переноса насекомыми, моллюсками, нематодами. Бактерии проникают в растения через устьица, нектарники и другие части растений, а также даже через небольшие повреждения. При проникновении бактерий внутрь растений происходит повреждение растительных клеток, они мацерируются и отслаиваются друг от друга. Такой путь проникновения называется интрацеллюлярным и межклеточным, а заболевания – паренхиматозными. В случаях распространения и размножения бактерий в сосудистых пучках происходит как бы закупоривание их просвета бактериальной массой. В результате этого процесса и действия бактериальных токсинов растения увядают.

2. Вирусы, которые делят на возбудителей:

1) мозаики, когда появляется пятнистая расцветка пораженных листьев и плодов, растения отстают в росте;

2) желтухи, которая проявляется карликовостью растений, измененными многочисленными боковыми побегами, цветками и т. д.

3. Грибы, поражающие растения, могут в случае приготовления из пораженного зерна продуктов питания вызывать пищевые отравления – микотоксикозы. Гриб поражает в поле колоски злаковых: образуются склероции гриба, называемые рожками.

Для борьбы с фитопатогенными микроорганизмами возделывают выносливые растения, очищают и обрабатывают семена, обеззараживают почву, удаляют пораженные растения, уничтожают переносчиков возбудителей болезней, обитающих на растениях.

2. Микробиологический контроль лекарственных средств

Обсеменение лекарственного сырья возможно на всех этапах его заготовки и при хранении. Увлажнение растений и растительного сырья способствует активному размножению микроорганизмов. Размножившись, микроорганизмы вызывают изменение фармакологических свойств препаратов, полученных из лекарственных растений. Микроорганизмы могут попадать из окружающей среды, от людей и обсеменять лекарственные препараты в процессе их изготовления из растительного сырья. Для соблюдения санитарного режима изготовления лекарственных препаратов проводят санитарно-микробиологический контроль объектов окружающей среды предприятия и каждой серии выпускаемой лекарственной формы. Лекарственные средства для парентерального введения в виде инъекций, глазные капли, мази, пленки и иное, в отношении которых имеются соответствующие указания в нормативно-технической документации, должны быть стерильными. Контроль стерильности лекарственных средств проводят путем посева на тиогликолевую среду для выявления различных бактерий, в том числе анаэробов; при посеве на среду Сабуро выявляют грибы, главным образом рода Candida. Стерильность лекарственных средств с антимикробным действием определяют путем мембранной фильтрации: фильтр после фильтрации исследуемого препарата делят на части и вносят для подращивания задержанных микроорганизмов в жидкие питательные среды. При отсутствии роста препарат считается стерильным.

Лекарственные средства, не требующие стерилизации, обычно содержат микроорганизмы, поэтому их испытывают на микробиологическую чистоту. Для этого проводят количественное определение жизнеспособных бактерий и грибов в 1 г или 1 мл препарата, а также выявляют микроорганизмы, которые не должны присутствовать в нестерильных лекарственных средствах. В 1 г или 1 мл лекарственного сырья для приема внутрь должно быть не более 1000 бактерий и 100 дрожжевых и плесневых грибов. В случаях местного применения количество микроорганизмов не должно превышать 100 микробных клеток на 1 г или 1 мл препарата. В таблетированных препаратах не должно быть патогенной микрофлоры, а общая обсемененность не должна превышать 10 тыс. микробных клеток на таблетку.

Тема 8. Основы медицинской биотехнологии

1. Краткая история развития биотехнологии

Как нам известно из древней истории, еще 6000–5000 лет до н. э. люди выпекали хлеб, варили пиво, готовили сыр, а из винограда делали вино. Они и не подозревали, что благодаря им уже в те далекие времена зародилась такая наука, как биотехнология. Не обоснованный научно, этот этап развития биотехнологии длился долгое время вплоть до XIX в., когда Л. Пастер открыл природу процесса брожения. Открытие этого процесса считается началом второго, научного этапа традиционной биотехнологии. С этого момента и по сегодняшний день получены и выделены ферменты, открыты и до сих пор открываются многие микроорганизмы. Кроме того, в результате изучения физиологии, биохимии и генетики микроорганизмов были разработаны способы их выращивания в массовых количествах; получены культуры животных и растительных клеток и разработаны способы их искусственного культивирования; получены многие продукты микробиологического синтеза, необходимые для медицины, сельского хозяйства и промышленности. Таким образом, вначале сформировалась техническая микробиология, а затем – биотехнология, при этом промышленное производство сводилось в основном к получению продуктов на основе природных штаммов.

С течением времени на основе достижений молекулярной биологии и микробиологии, генетики и генетической инженерии, иммунологии и химической технологии на смену старой биотехнологии пришла новая, основанная на применении искусственно получаемых штаммов – суперпродуцентов, использовании иммобилизованных ферментов, применении культур животных и растительных клеток, широком использовании генетической инженерии для получения клеток-рекомбинантов, моноклональных антител и других биологически активных веществ.

2. Понятие о биотехнологии, цели и задачи

Биотехнология – научное понятие, объединяющее в себе такие науки, как микробиология, молекулярная биология, генная инженерия, химическая технология и ряд других наук. Необходимость биотехнологии обусловлена потребностями общества в новых, более дешевых продуктах для народного хозяйства, в том числе медицины и ветеринарии, а также в принципиально новых технологиях.

Биотехнология – это получение продуктов из биологических объектов или с применением биологических объектов, в качестве которых могут быть использованы организмы животных и человека. Например, получение иммуноглобулинов из сывороток вакцинированных лошадей или людей; получение препаратов крови доноров; отдельные органы (получение гормона инсулина из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней) или культуры тканей (получение лекарственных препаратов). Но чаще всего в качестве биологических объектов используются одноклеточные микроорганизмы, а также животные и растительные клетки. Это обусловлено следующими причинами:

1) клетки являются своего рода биофабриками, которые в процессе жизнедеятельности вырабатывают разнообразные ценные продукты. Ими являются белки, жиры, углеводы, витамины, аминокислоты, антибиотики, гормоны, антитела, антигены, ферменты, спирты и иное, т. е. продукты, крайне необходимые в жизни человека, но недоступные для получения другими способами в связи со сложностью технологии процессов или экономической нецелесообразностью;

2) клетки чрезвычайно быстро воспроизводятся. Это их свойство позволяет за относительно короткое время искусственно вырастить на сравнительно дешевых и недефицитных питательных средах в промышленных масштабах огромные количества биомассы микробных, животных или растительных клеток;

3) биосинтез сложных веществ, таких как белки, антибиотики, антигены, антитела и иное, значительно экономичнее и технологически доступнее, чем химический синтез;

4) возможность проведения биотехнологического процесса в промышленных масштабах при наличии соответствующего технологического оборудования и аппаратуры, доступность сырья, технологии переработки и др.

Клетки животных и растений, микробные клетки в процессе ассимиляции и диссимиляции (или жизнедеятельности) образуют новые продукты и выделяют метаболиты, обладающие разнообразными физико-химическими свойствами и биологическим действием. При этом продукты ассимиляции и диссимиляции предложено делить на 4 категории:

1) сами клетки как источник целевого продукта. К примеру, для получения живой или убитой корпускулярной вакцины используют выращенные бактерии или вирусы; а дрожжи используют как кормовой белок или основу для получения гидролизатов питательных сред и т. д.;

2) макромолекулы, синтезирующиеся клетками в процессе выращивания. К ним относятся ферменты, токсины, антигены, антитела, пептидогликаны и др.;

3) первичные метаболиты – низкомолекулярные вещества, необходимые для роста клеток. Ими являются аминокислоты, витамины, нуклеотиды, органические кислоты;

4) вторичные метаболиты – низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста клеток. Ими являются антибиотики, алкалоиды, токсины и гормоны.

Биотехнология использует эту продукцию клеток как сырье, которое в результате технологической обработки превращается в конечный продукт, который может использоваться в различных отраслях: в медицине для производства антибиотиков, витаминов, ферментов, аминокислот, гормонов, вакцин, антител, компонентов крови, диагностических препаратов, иммуномодуляторов, алкалоидов, пищевых белков, нуклеиновых кислот, нуклеозидов, нуклеотидов, липидов, антиметаболитов, антиоксидантов, противоглистных и противоопухолевых препаратов; в химической промышленности используют ацетон, этилен, бутанол; в пищевой промышленности используют аминокислоты, органические кислоты, пищевые белки, ферменты, липиды, сахара, спирты, дрожжи; в ветеринарии и сельском хозяйстве используют кормовой белок для производства кормовых антибиотиков, витаминов, гормонов, вакцин, а также биологических средств защиты растений и инсектицидов; в энергетике – биогаз и этанол.

Достижения в биотехнологии позволяют применять ее для решения проблем, связанных с нарушением экологии (например, для очистки сточных вод, переработки отходов и побочных продуктов производства, а также их дегидратации (фенола, нефтепродуктов и других вредных веществ, пагубно влияющих на окружающую среду) с помощью микроорганизмов.

В настоящее время в биотехнологии выделяют медико-фармацевтическое, продовольственное, сельскохозяйственное и экологическое направления, поэтому биотехнология подразделяется на медицинскую, сельскохозяйственную, промышленную и экологическую.

Медицинская биотехнология подразделяется на фармацевтическую и иммунобиологическую, сельскохозяйственная – на ветеринарную и биотехнологию растений, промышленная – на соответствующие отраслевые направления (пищевая, легкая промышленность, энергетика и т. д.).

Кроме того, биотехнология подразделяется на старую (традиционную) и новую, которую чаще связывают с генной инженерией.

Таким образом, можно сказать, что биотехнология в некоторой степени является не только наукой, но и производством. Доказательством этого может служить тот факт, что промышленное производство в биотехнологии, основанное на принципах брожения (ферментация), биоконверсии (превращение одного вещества в другое), культивировании растительных и животных клеток, бактерий и вирусов, генетических манипуляциях, невозможно без промышленного оборудования и аппаратуры, отработки и оптимизации технологических процессов, разработки способов оценки и контроля продукции на всех ее стадиях. В связи с этим биотехнологическая промышленность в своем распоряжении имеет крупные заводы, опытно-конструкторские учреждения, научно-исследовательские институты. И хотя на предприятиях промышленной биотехнологии вырабатывается огромное количество (буквально тысячи тонн) продукции, тем не менее потребности быстрорастущего народного хозяйства биотехнология в полной мере удовлетворить не в состоянии. Поэтому развитию биотехнологии в настоящее время уделяется постоянное внимание, и эта отрасль быстро развивается.

3. Микроорганизмы, клетки и процессы, применяемые в биотехнологии

Как нам известно, в природе существует огромное число микроорганизмов, каждый из которых способен синтезировать продукты или осуществлять реакции, которые могут быть пригодны для использования в биотехнологии. На современном этапе развития биотехнологии практическое применение нашло около 100 видов микроорганизмов – бактерии, грибы, дрожжи, вирусы, водоросли, т. е. наиболее изученные.

Дрожжи широко используют в хлебопечении, пивоварении, виноделии, выработки кормового белка, питательных сред для выращивания бактерий и культур животных клеток. Из 500 известных видов дрожжей используется лишь Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergencis, Saccharomyces uwarum.

Среди бактерий в биотехнологии применяют представителей таких родов, как:

1) Acetobacter, превращающих этанол в уксусную кислоту, а уксусную кислоту – в углекислый газ и воду;

2) Bacillus – для получения ферментов (В. subtilis), средств защиты растений (В. thuringiensis);

3) Clostridium – для сбраживания сахаров в ацетон, этанол, бутанол;

4) молочнокислые бактерии (Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus);

5) псевдомонады (например, P. denitrificans – для получения витамина В₂, Corynebacterium glutamatum – для получения аминокислот и др.).

Актиномицеты (род Streptomyces), грибы Penicillium chrysogenum, Cephalosporium acremonium и иные применяются в биотехнологии для получения разнообразных антибиотиков.

Кроме того, бактерии, дрожжи и вирусы используют в качестве рецепиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов – продуцентов биотехнологической продукции. Например, получены рекомбинантные штаммы Е. coli, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормон роста, антигены вируса СПИДа; штаммы В. subtilis, вырабатывающие интерферон; штаммы дрожжей, продуцирующих интерлейкин-2, антиген вируса гепатита В; рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены гепатита В, вируса бешенства, клещевого энцефалита и др.

Для получения вакцин и диагностических препаратов используют и патогенные микроорганизмы (брюшного тифа, коклюша, дифтерии, столбняка и др.).

Культуры животных и растительных клеток, строение, физиология, процесс культивирования которых являются более сложными, чем бактериальных клеток, также нашли широкое применение в биотехнологии. Тем не менее из культур тканей растений получают разнообразные соединения, используемые в медицине, и прежде всего алкалоиды, противовоспалительные вещества, противолейкозные и противоопухолевые, противобактериальные, сердечные и почечные средства, ферменты, витамины, опиаты и иное, сельском хозяйстве, химической и других отраслях промышленности. Кроме того, животные клетки используют не только для получения продукции, синтезируемой клетками, но и для выращивания в клетках вирусов с целью получения из них вакцин и диагностических препаратов.

Основными условиями успешного проведения технологического процесса получения продуктов микробного или клеточного синтеза являются:

1) выбор или получение высокопродуктивного промышленного штамма-продуцента и поддержание его в активном состоянии. Это обусловлено тем, что различные штаммы могут иметь существенные различия по количеству и качеству продукции того или иного вещества, что в значительной мере сказывается на экономической эффективности и активности целевого продукта;

2) подбор питательных сред, которые смогли бы обеспечить максимальное накопление биомассы или целевого продукта. При этом питательные среды должны состоять из дешевого, недефицитного и доступного сырья. С этой целью в крупномасштабном производстве для приготовления питательных сред служит обычно сравнительно дешевое сырье, которым являются меласса, парафины нефти, дрожжи, уксусная кислота, природный газ. При получении медицинских препаратов применяются казеин, препараты крови, среды из мясных гидролизатов.

С целью получения продукции в максимальных количествах активный штамм-продуцент выращивают на оптимальной питательной среде в оптимальных условиях культивирования. Выращивание проводят в ферментаторах, или культиваторах, вместимость которых может варьировать от 2 л до 100–400 м³ в зависимости от потребности в продукте. Процесс культивирования ведется в асептических условиях, чтобы получить чистые культуры целевых микроорганизмов или культуры клеток.

В ферментаторах применяют суспензионное (глубинное) культивирование, реже поверхностное – на плотных питательных средах (бактерии, грибы) или в жидком монослое (культуры животных клеток).

Полученную биомассу микроорганизмов или культуры клеток подвергают переработке, вид которой определяется технологией получения целевого продукта.

Наиболее типовые процессы:

1) концентрирование биомассы сепарированием, центрифугированием и приготовление из нее жидкого или сухого продукта;

2) высушивание, проводимое лиофильным способом из замороженного состояния или путем распыления в потоке теплого воздуха в специальных лиофильных аппаратах и распылительных сушилках;

3) сбор центрифугата после отделения биомассы и выделения из нее целевого продукта. В некоторых случаях предварительно прибегают к разрушению клеток механическим, осмотическим или ультразвуковым способом с целью увеличения выхода целевого продукта.

Если из биомассы или центрифугата необходимо выделить активную субстанцию (витамин, аминокислоту, антиген, фермент и др.), то применяют многоступенчатые физические (сепарирование, центрифугирование) или физико-химические (осаждение нейтральными солями, спиртом, ацетоном, ультрафильтрацию, хроматографию, электрофорез) методы очистки, выбор которых зависит от свойств выделяемого вещества, зависящих от природы, молекулярной массы, лабильности к внешним воздействиям и т. д. Чистота получаемого продукта определяется наличием в нем примесей и выражается коэффициентом очистки – отношением числа активных единиц продуктов к 1 мг белка или азота (так называемая удельная активность) в очищенном препарате к удельной активности исходного продукта.

Как правило, в препаратах активная субстанция содержит примеси питательных сред, на которых выращивали микроорганизмы, а также продукты метаболизма и продукты распада микробной клетки. К примесям относятся белки, полисахариды и их комплексы, нуклеиновые кислоты, соли и другие низкомолекулярные вещества – бесполезные для препаратов, но нередко вызывающие нежелательные побочные реакции организма при применении препаратов в виде местных реакций, повышения температуры тела, аллергических проявлений. Этим объясняется стремление к получению препаратов, содержащих активную субстанцию в максимально очищенном состоянии.

После получения активной субстанции из нее конструируют конечный препарат, который в зависимости от назначения и способа применения может быть в жидком или сухом состоянии или в виде мазей. Поскольку он может быть предназначен для наружного, парентерального или энтерального, аэрозольного применения, то может быть стерильным и нестерильным.

Кроме того, конечный препарат, помимо примесей (от которых не удалось освободиться), содержит и необходимые добавки, которыми являются консерванты для поддержания стерильности препарата при хранении, стабилизаторы для повышения устойчивости лабильного активного начала при хранении, активаторы.

В конечной композиции препарат фасуется, этикетируется и снабжается инструкцией по применению.

Каждая серия препарата проходит стандартизацию в соответствии с технической документацией на производстве и в Государственном институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича или в Фармакологическом комитете в зависимости от назначения препарата.

Тема 9. Генная инженерия и область ее применения в биотехнологии

1. Понятие и сущность генной инженерии

Основой биотехнологии является генная инженерия, которая по существу сводится к генетической рекомбинации (т. е. обмену генами между двумя хромосомами), приводящей к возникновению клеток или организмов с двумя и более наследственными детерминантами (генами), по которым родители различались между собой. Метод рекомбинации заключается в:

1) выделении ДНК из разных видов организмов или клеток;

2) получении гибридных молекул ДНК;

3) введении рекомбинантных (гибридных) молекул в живые клетки;

4) создании условий для экспрессии и секреции продуктов, кодируемых генами.

Гены, кодирующие те или иные структуры, выделяются из хромосом или плазмид, прицельно выщепляются из этих генетических образований с помощью ферментов рестрикции или синтезируются химически. Набор ферментов, способных резать ДНК по определенным связям, является важным инструментом генетической инженерии. В последнее время обнаружены ферменты, расщепляющие по определенным связям РНК наподобие рестрикции ДНК, поэтому их называют рибозимами, но их роль пока до конца не изучена.

С помощью химического синтеза могут быть получены сравнительно небольшие гены. Для этого вначале расшифровывают число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества и по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене, так как каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида. С помощью синтезатора химическим путем создают ген, аналогичный природному гену.

Полученный таким образом целевой ген сшивают с другим геном с помощью ферментов лигаз. В дальнейшем он используется в качестве вектора для встраивания гибридного гена в клетку. В качестве вектора могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, животных и растений.

Количество плазмид в бактериальной клетке может колебаться от одной до нескольких сотен и зависит от размера плазмиды: чем большие размеры она имеет, тем меньше ее копий в клетке. С помощью ампфликации генов (увеличения числа копий определенного гена в клетке) можно резко повысить производство кодируемого вещества клеткой.

Бактериофаг как вектор используется аналогично. Целевой ген встраивается в геном фага, реплицируется вместе с генами вируса при размножении последнего в бактериальной клетке. Чаще всего используется фаг ламбда, содержащий ДНК из 50 000 пар нуклеотидов. Его преимущество перед плазмидами заключается в том, что фаговый вектор позволяет клонировать большие фрагменты чужеродной ДНК.

В случае использования в качестве векторов вирусов человека, животных и растений чужеродный ген встраивают в ДНК вируса. Он реплицируется вместе с размножением последнего в клетке.

Применяют в качестве вектора и космиды – гибрид плазмиды с фагом, использующийся для клонирования больших фрагментов ДНК эукариот.

Для РНК-содержащих вирусов передача генетической информации возможна с помощью ревертазы, передающей информацию о структуре белка от РНК к ДНК, являющейся комплементарной РНК.

Получение рекомбинантных молекул ДНК и рекомбинантных бактерий сводится к тому, что экспрессируемый ген в виде рекомбинантной ДНК встраивается в бактериальную или животную клетку, приобретающую новое свойство – способность продуцировать несвойственное этой клетке вещество, кодируемое экспрессируемым геном. Для лучшего проникновения вектора через стенку бактерий иногда прибегают к воздействию на стенку (например, хлоридом кальция), чтобы увеличить ее проницаемость.

В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используют Е. coli, В. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы с учетом возможности встройки чужеродного гена, а также уровня выраженности (экспрессии) синтеза вещества, кодируемого геном, возможности его секреции в окружающую среду, легкости и доступности массового культивирования, экологической безопасности. Некоторые штаммы рекомбинантных бактерий способны переключать на синтез чужеродного вещества, экспрессируемого геном, до 50 % своего синтетического потенциала, поэтому они нашли применение в биотехнологической промышленности и называются промышленными штаммами.

Некоторые штаммы микроорганизмов хорошо экспрессируют чужеродные гены, но плохо секретируют продукт в окружающую среду. В таких случаях применяют дезинтеграцию, или разрушение, клетки с целью высвобождения из нее синтезированного продукта.

В некоторых случаях, несмотря на наличие экспрессии и секреции, продукт не удается получить из-за разрушения в процессе синтеза или после него протеазами и другими ингибиторами.

С целью повышения уровня секреции целевого белка к гену целевого белка присоединяют ген белка, хорошо секретируемого клеткой рецепиента. В результате образованный химерный белок, хорошо секретируемый клеткой, собирают и от него отщепляют целевой белок. Также возможно присоединение гениндикатора к гену целевого белка, в результате чего получают химерный индикаторный белок, а из него – целевой белок.

2. Биологические препараты, полученные методом генной инженерии

Несмотря на то что методом генной инженерии получена не одна сотня препаратов, в практику внедрена только часть: интерфероны, интерлейкины, фактор VIII, инсулин, гормон роста, тканевый активатор плазминогена, вакцина против гепатита В, моноклональные антитела для предупреждения отторжения при пересадках почки, диагностические препараты для выявления ВИЧ и др. Это обусловлено несколькими факторами.

1. Невозможность управлять распространением экологически опасных рекомбинантных микроорганизмов, хотя в последнее время эти опасения отвергнуты;

2. Использование рекомбинантных штаммов продуцентов предусматривает разработку сложных технологических процессов по получению и выделению целевых продуктов, на которую уходит значительное количество времени, а также средств.

3. При получении препаратов методом геннной инженерии требуется проведение исследовательских работ, направленных на доказательство идентичности, а также иногда – решение дополнительных задач по приданию продукту природного характера.

Медицинскими препаратами, разрабатываемыми методами современной биотехнологии, являются антикоагулянты и тромболитики – тканевые активаторы плазминогена, фиксаторы VIII и IX; колониестимулирующие факторы – соматомедин С, гранулоцитный и макрофагальный колониестимулирующие факторы; иммуноцитокины – интерфероны, интерлейкины, фактор некроза опухолей, пептиды вилочковой железы и иные; гормоны – гормоны роста, инсулин, эритропоэтин; вакцины против ВИЧ-инфекции, малярии, гепатита В и иные; ферменты – липаза, протеазы; рецепторы – Т-4 лимфоцитов и др.; моноклональные антитела для иммунотерапии опухолей, предупреждения реакций отторжения; диагностикумы для выявления ВИЧ-инфекции, сифилиса, гепатита В и др.

Метод генной инженерии является одним из самых перспективных при получении многих белковых биологических веществ, представляющих ценность для медицины. В области создания биологически активных веществ медицинского назначения с помощью данного метода создаются препараты второго поколения, являющиеся аналогами природных веществ, обладающими большей эффективностью действия.

При определении целесообразности и экономичности методов генной инженерии для получения медицинских или других препаратов учитываются:

1) доступность;

2) экономичность;

3) качество получаемого препарата;

4) новизна;

5) безопасность проведения работ и др.

Положительные стороны метода генной инженерии перед остальными заключаются в следующем.

1. Природный микроорганизм или животные и растительные клетки не культивируются в промышленных условиях. С целью получения диагностических препаратов или вакцин прибегают к клонированию или синтезу генов протективных антигенов, их встраиванию в легко культивируемые бактерии. При выращивании этих рекомбинантных бактерий-рецепиентов получают нужные антигены, являющиеся основой для создания диагностического препарата или вакцины.

2. Микроорганизм высоко патогенен и опасен при промышленном производстве. Так, для получения ВИЧ-диагностических препаратов и вакцин необходимые антигены получают методом генной инженерии.

3. Исходное сырье для получения препарата традиционным способом является дефицитным или дорогостоящим.

4. Метод активно используется для получения принципиально новых продуктов и препаратов, не существующих в природе. Например, только с помощью генной инженерии можно получить рекомбинантные поливалентные живые вакцины, несущие антигены нескольких микроорганизмов.

5. Метод позволяет заменить многие методы, основанные на получении продуктов in vivo, на способы получения этих продуктов in vitro. Так, если ранее диагностические, лечебные и профилактические сыворотки получали из крови иммунизированных лошадей или вакцинированных людей-доноров, то в настоящее время предпочтение отдается гибридомной технике получения антител, основанной на получении клеток-гибридов путем слияния В-лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных, и миеломных (раковых) клеток, способных быстро размножаться на искусственных питательных средах и продуцировать при этом антитела к антигену, использованному для иммунизации.

6. Метод позволяет получать многие фармакологические вещества путем выращивания в промышленных условиях культур клеток лекарственных растений.

Тема 10. Антибиотики и химиотерапия

1. Химиотерапевтические препараты

Химиотерапия – лечение инфекционных и опухолевых заболеваний химическими препаратами, не являющимися продуктами реакции организма на возбудителя.

Химиотерапевтические препараты – это лекарственные вещества, используемые для подавления жизнедеятельности и уничтожения микроорганизмов в тканях и средах больного, обладающие избирательным, этиотропным (действующим на причину) действием.

Химиопрепараты должны обладать такими качествами, как:

1) хорошее растворение в воде, что обеспечивает доставку лекарственного вещества во внутреннюю среду организма. Малорастворимые или нерастворимые вещества пригодны только для местного применения, для внутреннего применения используются их соответствующие производные;

2) достаточная стабильность во внутренней среде организма при отсутствии кумулятивного эффекта (способности накапливаться в макроорганизме);

3) безвредность. Хотя любой химиотерапевтический препарат в той или иной мере оказывает побочное действие на организм человека, оно должно быть по возможности минимальным, а способность вызывать образование отклонений в развитии мутации по возможности должны отсутствовать.

Безвредность оценивается химиотерапевтическим индексом – отношением минимальной терапевтической дозы препарата к максимально переносимой. Следовательно, чем меньше показатель, тем лучше препарат. Индекс препарата, приближающийся к 1, свидетельствует о том, что данное вещество не может быть использовано как средство химиотерапии.

По направленности действия химиотерапевтические препараты делят на:

1) противопротозойные;

2) противогрибковые;

3) противовирусные;

4) антибактериальные. При этом в связи с особенностями возбудителей среди антибактериальных препаратов отдельно выделяются противотуберкулезные (антимикобактериальные) и противосифилитические средства.

Химиотерапевтические препараты делятся по способности накапливаться в тех или иных органах. Например, цитостатики накапливаются в опухолевых клетках, тем самым подавляя их рост; уросептики накапливаются в моче, подавляя развитие возбудителей инфекций почек и мочевыводящих путей.

По химическому строению выделяют несколько групп химиотерапевтических препаратов:

1) сульфаниламидные препараты (сульфаниламиды) – производные сульфаниловой кислоты. Они нарушают процесс получения микробами необходимых для их жизни и развития ростовых факторов – фолиевой кислоты и других веществ. К этой группе относят стрептоцид, норсульфазол, сульфаметизол, сульфометаксазол и др.;

2) производные нитрофурана. Механизм действия состоит в блокировании нескольких ферментных систем микробной клетки. К ним относят фурациллин, фурагин, фуразолидон, нитрофуразон и др.;

3) хинолоны. Нарушают различные этапы синтеза ДНК микробной клетки. К ним относят налидиксовую кислоту, циноксацин, норфлоксацин, ципрофлоксацин;

4) азолы – производные имидазола. Обладают противогрибковой активностью. Ингибируют биосинтез стероидов, что приводит к повреждению наружной клеточной мембраны грибов и повышению ее проницаемости. К ним относят клортимазол, кетоконазол, флуконазол и др.;

5) диаминопиримидины. Нарушают метаболизм микробной клетки. К ним относят триметоприм, пириметамин;

6) антибиотики – это группа соединений природного происхождения или их синтетических аналогов.

Принципы классификации антибиотиков

I. По механизму действия:

1) нарушающие синтез микробной стенки (β-лактамные антибиотики; циклосерин; ванкомицин, тейкоплакин);

2) нарушающие функции цитоплазматической мембраны (циклические полипептиды, полиеновые антибиотики);

3) нарушающие синтез белков и нуклеиновых кислот (группа левомицетина, тетрациклина, макролиды, линкозамиды, аминогликозиды, фузидин, анзамицины).

II. По типу действия на микроорганизмы:

1) антибиотики с бактерицидным действием (влияющие на клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану);

2) антибиотики с бактериостатическим действием (влияющие на синтез макромолекул).

III. По спектру действия:

1) с преимущественным действием на грамположительные микроорганизмы (линкозамиды, биосинтетические пенициллины, ванкомицин);

2) с преимущественным действием на грамотрицательные микроорганизмы (монобактамы, циклические полипептиды);

3) широкого спектра действия (аминогликозиды, левомицетин, тетрациклины, цефалоспорины).

IV. По химическому строению:

1) β-лактамные антибиотики:

а) пенициллины, среди которых выделяют природные (аминипенициллин) и полусинтетические (оксациллин);

б) цефалоспорины (цепорин, цефазолин, цефотаксим);

в) монобактамы (примбактам);

г) карбапенемы (имипинем, меропинем);

2) аминогликозиды (канамицин, неомицин);

3) тетрациклины (тетрациклин, метациклин);

4) макролиды (эритромицин, азитромицин);

5) линкозамины (линкомицин, клиндамицин);

6) полиены (амфотерицин, нистатин);

7) гликопептиды (ванкомицин, тейкоплакин);

8) полипептиды (грамицидин, полимиксин М и В);

9) антрациклиновые антибиотики (к ним относятся противоопухолевые антибиотики – доксорубицин, карминомицин, рубомицин, акларубицин).

2. Основные осложнения химиотерапии

Все осложнения химиотерапии можно разделить на две группы: осложнения со стороны макроорганизма и со стороны микроорганизма.

Осложнения со стороны макроорганизма

Осложнения со стороны макроорганизма следующие.

1. Аллергические реакции наблюдаются в 10 % случаев и характеризуются появлением сыпи, зуда, крапивницы и др. Степень выраженности может быть различной – от легких форм до анафилактического шока. Наличие аллергии на один из препаратов группы является противопоказанием для использования и других препаратов этой группы, так как возможна перекрестная чувствительность.

2. Прямое токсическое действие зависит от свойств препарата, его дозы, способа введения и состояния больного. Наиболее частым побочным действием этой группы является поражение печени. Подобным действием обладают тетрациклины, при этом они нарушают формирование костной ткани и зубов. Прием аминогликозидов приводит к поражению печени и почек, что связано с их обезвреживающей и выделительной функциями. Кроме этого, аминогликозиды могут вызывать необратимое поражение слухового нерва. Левомицетин может поражать органы кроветворения, а также оказывает эмбриотоксическое действие. Ципрофлоксацин может оказывать нейротоксическое действие, фторхинолоны – вызывать артропатии. Наименее токсичным является пенициллин, но при его длительном использовании возможно поражение центральной нервной системы.

3. Побочные токсические эффекты. Эти осложнения связаны не с прямым, а с опосредованным действием на различные системы организма. Антибиотики, действующие на синтез белка и нуклеиновый обмен, всегда угнетают иммунную систему. Хлорамфеникол может подавлять синтез белков в клетках костного мозга, вызывая лимфопению. Фурагин, проникая через плаценту, может вызывать гемолитическую анемию плода.

4. Реакции обострения. При применении химиотерапевтических средств в первые дни заболевания может происходить массовая гибель возбудителей, сопровождающаяся освобождением большого количества эндотоксина и других продуктов распада. Это может сопровождаться ухудшением состояния вплоть до токсического шока. Такие реакции чаще бывают у детей. Поэтому антибиотикотерапия должна сочетаться с дезинтоксикационными мероприятиями.

5. Развитие дисбиоза. Он чаще возникает на фоне применения антибиотиков широкого спектра действия. Предупредить развитие этого вида осложнений невозможно, но реально свести до минимума его последствия. С этой целью рекомендуется использовать антибиотики узкого спектра действия; параллельно антибактериальным антибиотикам назначать противогрибковые препараты; применять эубиотики для восстановления нормальной микрофлоры.

Осложнения со стороны микроорганизма

Проявляются развитием лекарственной устойчивости. В ее основе лежат мутации хромосомных генов или приобретение плазмид устойчивости. Существуют роды микроорганизмов, обладающие природной устойчивостью.

Биохимическую основу устойчивости обеспечивают следующие механизмы:

1) энзиматическая инактивация антибиотиков. Этот процесс обеспечивается с помощью синтезируемых бактериями ферментов, разрушающих активную часть антибиотиков;

2) изменение проницаемости клеточной стенки для антибиотика или подавление его транспорта в бактериальные клетки;

3) изменение структуры компонентов микробной клетки.

Развитие того или иного механизма резистентности зависит от химической структуры антибиотика и свойств бактерий.

Методы борьбы с лекарственной устойчивостью:

1) поиск и создание новых химиотерапевтических препаратов;

2) создание комбинированных препаратов, которые включают в себя химиотерапевтические средства различных групп, усиливающих действие друг друга;

3) периодическая смена антибиотиков;

4) соблюдение основных принципов рациональной химиотерапии.

3. Принципы рациональной химиотерапии

Принципы рациональной химиотерапии состоят в следующем.

1. Микробиологический принцип – назначение лекарственных препаратов строго по показаниям, т. е. только в тех случаях, когда без них нельзя обойтись, с учетом противопоказаний (например, повышенной чувствительности или аллергической реакции к препаратам той или иной группы).

Выбор препарата для химиотерапии может проводиться в различных вариантах возникающих ситуаций.

При этиологически расшифрованных заболеваниях выбор препарата должен определяться с учетом чувствительности возбудителя (антибиотикограмма), выделенного от данного конкретного больного в результате бактериологического исследования.

При выделении возбудителя, но без определения его чувствительности к химиотерапевтическим препаратам, или при эмпирической инициальной химиотерапии заболевания с неидентифицированным, но предполагаемым возбудителем выбор препарата для химиотерапии должен основываться на показателях антибиотикочувствительности соответствующих микроорганизмов (наиболее вероятных возбудителей данной нозологической формы заболевания) по данным литературы или при ориентации на данные о региональной чувствительности тех или иных инфекционных агентов-возбудителей данного заболевания.

2. Фармакологический принцип. При выборе препарата необходимо учитывать данные его фармакокинетики.

Лечение должно проводиться строго по схеме, рекомендованной для выбранного химиопрепарата (способ и кратность введения препаратов, длительность лечения) с учетом коэффициента увеличения концентрации препарата в целях создания эффективных концентраций препарата непосредственно в органах и тканях (примерно 4 МПК – минимальная подавляющая концентрация, определенная по возможности методом серийных разведений).

Длительность приема химиопрепаратов должна составлять как минимум 2–3 дня – в целях профилактики формирования устойчивых к данному препарату штаммов возбудителей, а также формирования бактерионосительства.

При дерматомикозах, кандидозе и трихомониазе влагалища с целью предупреждения рецидивов лечение продолжают в течение 2–4 недель после исчезновения симптомов заболевания.

3. Принцип иммунохимиотерапии. Химиотерапию желательно проводить с помощью средств, способствующих повышению активности защитных механизмов макроорганизма.

Весьма эффективны при проведении химиотерапии комбинации препаратов с различными механизмами и спектром действия.

Однако при комбинированном применении препаратов необходимо учитывать несколько факторов:

1) лекарственную совместимость предполагаемых к совместному использованию химиопрепаратов;

2) возможность того, что препараты, содержащие одно и то же вещество в качестве активного действующего начала, могут носить различные торговые названия, так как выпускаются разными фирмами и могут быть дженериками (препаратами, производимыми по лицензии с оригинала) одного и того же химиопрепарата;

3) комбинированное применение антибиотиков повышает риск развития дисбаланса нормальной микрофлоры.

4. Клинический принцип. При назначении препаратов следует учитывать общее состояние больного, возраст, пол, состояние иммунной системы, сопутствующие заболевания, а также наличие беременности.

5. Эпидемиологический принцип. Подбирая химиопрепарат, необходимо учитывать, к каким лекарственным препаратам микроорганизмы устойчивы в среде, в которой находится больной. Распространенность устойчивости к данному препарату не остается постоянной и изменяется в зависимости от того, насколько широко используется препарат.

6. Фармацевтический принцип. Необходимо учитывать срок годности и условия хранения препарата, поскольку при истечении срока годности и несоблюдении правил хранения в нем образуются токсичные продукты деградации.